加减异功散体外改善脾虚犬肠道菌群结构及修复Caco-2细胞黏膜屏障的分子机制

摘要

旨在基于网络药理学研究加减异功散(modified Yigong powder, MYG)治疗脾虚证的分子机制，并分析MYG对模拟胃肠脾虚犬肠道菌群及Caco-2细胞黏膜屏障的影响，以及肠道菌群与黏膜屏障间的互作效应。利用网络药理学方法预测MYG治疗脾虚证的分子机制。试验采集3只(12±1)岁脾虚柯基犬粪样后，建立体外胃肠模拟体系，分为原始粪样组、胃肠模拟组和胃肠模拟加异功散组，并利用16S rDNA法检测各组菌群结构变化。再从胃肠模拟加异功散组中提取代谢产物，研究其对LPS诱导的Caco-2细胞黏膜屏障损伤模型的影响，细胞试验分为空白对照组、模型组、异功散代谢产物组，进行荧光素钠通透性测定，并利用qPCR检测Claudin-1、Occludin与ZO-1 mRNA表达量。进一步对MYG干预后的肠道菌群与Caco-2细胞黏膜屏障指标进行相关性分析。结果显示，MYG有76个活性成分和45个治疗脾虚证的潜在靶点，蛋白互作分析得40个关键靶点，GO富集得34个条目，KEGG富集得16条通路；在胃肠模拟体系中，与胃肠模拟组相比，胃肠模拟异功散组在门水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)和放线菌门(Actinobacteriota)丰度显著增加(P<0.05),变形菌门(Proteobacteria)丰度显著降低(P<0.05),在属水平上，梭杆菌属(Fusobacterium)、瘤胃球菌属([Ruminococcus]gnavus group)和布劳特菌属(Blautia)丰度显著增加(P<0.05),大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)丰度显著降低(P<0.05),菌群的多样性指数也显著升高(P<0.05);在细胞试验中，与模型组相比，异功散代谢产物组Caco-2细胞黏膜通透性极显著降低(P<0.001),Claudin-1、Occludin与ZO-1 mRNA表达量极显著增加(P<0.001);通过相关性分析，发现菌群结构与黏膜屏障指标有一定相关性。综上，MYG可能通过槲皮素、花生四烯酸、柚皮素等76个活性成分，作用于TNF、IL6、IL18、CXCL8、AKT1等40个关键靶点，通过AGE-RAGE、FoxO、HIF-1等16条信号通路治疗犬脾虚证。此外，MYG的胃肠代谢产物能够上调紧密连接蛋白mRNA的表达量，降低黏膜通透性，修复黏膜屏障，这可能与MYG调节菌群结构有关。

关键词

加减异功散 / 网络药理学 / 胃肠模拟 / 肠道菌群 / 黏膜屏障 / 脾虚犬