布鲁菌分泌蛋白BspE互作的宿主蛋白的筛选、验证及功能分析

摘要

为了探究BspE蛋白在布鲁菌感染中的作用，利用酵母双杂交技术筛选与BspE蛋白互作的宿主细胞蛋白质。以构建的BspE重组质粒pGBKT7-BspE作为诱饵质粒，采用酵母双杂交技术，与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7-cDNA文库进行杂交。将获得的阳性克隆菌落经质粒抽提、测序分析和免疫共沉淀试验，确定可与BspE互作的宿主细胞蛋白。利用激光共聚焦显微镜分析BspE蛋白的亚细胞定位。利用生物信息学分析BspE互作蛋白的理化性质、蛋白结构、功能等信息。合成其中一个BspE互作蛋白的siRNA,沉默HEK293T细胞该蛋白基因的表达，将布鲁菌M5-90感染沉默的细胞，进行胞内细菌数量计数。结果显示，成功构建诱饵质粒pGBKT7-BspE,该质粒可在酵母菌中表达BspE蛋白。采用酵母双杂交技术从宿主细胞基因组文库获得8个阳性克隆，经测序、回交试验、免疫共沉淀验证后明确可与BspE蛋白互作的宿主蛋白为RBM27和PCBP1;利用生物信息学预测分析RBM27和PCBP1的细胞定位、蛋白结构及氨基酸种类组成；通过siRNA干扰后，PCBP1表达水平显著下降，胞内M5-90数量增加。研究表明，布鲁菌分泌蛋白BspE与宿主蛋白RBM27和PCBP1存在相互作用，且PCBP1对布鲁菌的增殖具有负调控作用。

关键词

布鲁菌 / 酵母双杂交 / 免疫共沉淀 / 互作蛋白 / 生物信息学分析 / RNA干扰