发热伴血小板减少综合征病毒Gn蛋白D Ⅲ-Ⅲ的表达与抗体间接ELISA检测方法的建立

摘要

利用PCR技术扩增发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)Gn-DⅢ-Ⅲ基因，将其插入pET-30a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET-SFTSV-Gn-DⅢ-Ⅲ,将测序正确的pET-SFTSV-Gn-DⅢ-Ⅲ转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，优化Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白表达表达条件。利用镍柱亲和层析法纯化的Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白作为包被抗原，建立检测SFTSV抗体的间接ELISA方法，并进行评价。结果显示，通过PCR和测序鉴定重组质粒pET-SFTSV-Gn-DⅢ-Ⅲ构建成功；重组Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白为可溶性表达，其最佳诱导条件为：0.4 mmol/L IPTG于25℃诱导4 h;经镍柱纯化后蛋白纯度高达91.77%;SFTSV抗体间接ELISA检测方法的的最佳反应条件为：5 mg/L的包被质量浓度，一抗在37℃孵育1.5 h,二抗1∶10 000稀释后在37℃孵育1 h。特异性试验结果显示该方法与裂谷热病毒(Rift Valley fever virus; RVFV)、埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)和蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)阳性血清均无交叉反应；敏感性试验结果显示该方法有较高的敏感性，SFTSV阳性血清稀释至81 920倍时其P/N仍大于2.1;重复性结果表明批内和批间反应变异系数均小于10%。应用所建立方法检测了4份人类感染SFTSV不同阶段的临床血清样本，结果缓解期患者血清P/N值大于2.1,为阳性，多器官衰竭期患者血清P/N值小于2.1,为阴性。结果表明，本研究成功表达并纯化了SFTSV Gn-DⅢ-Ⅲ蛋白，并以此为包被蛋白建立SFTSV抗体间接ELISA检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于检测人类SFTSV临床血清样本。

关键词

发热伴血小板减少综合征病毒 / Gn蛋白DomainⅢ / 原核表达 / 间接ELISA