猪伪狂犬病病毒LAMP-Taqman检测方法的建立与应用

摘要

基于环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）和荧光定量PCR技术建立一种猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）LAMP-Taqman快速检测体系。针对PRV保守序列设计LAMP引物组，并将环引物修饰荧光基团和淬灭基团作为Taqman探针，以实际阳性样本和重组质粒为模板，测试体系组分添加量、特异性、灵敏度和重复性；同时，使用市售恒温检测试剂盒平行测试38份实际样本，验证LAMP-Taqman检测体系的实际检测效果。结果显示，各组分最佳终浓度为：PRV-FIP/BIP 0.8μmol/L,Bst DNA聚合酶0.7 U/μL,TaqDNA聚合酶0.24 U/μL,dNTPs 1.6 mmol/L,MgSO₄ 7.2 mmol/L;体系特异性好，不与其他病毒样本产生交叉反应，梯度样本的线性相关系数（R²）为0.995,重复性测试的变异系数小于3.000%,最低检出限可达2.81×10～2拷贝/μL;对实际样本的测试结果与市售恒温荧光法检测试剂完全一致。结果表明，基于LAMP-Taqman方法建立的PRV检测体系特异灵敏、稳定准确，是一种适用于猪群PRV精准检测的可靠技术方法。

关键词

伪狂犬病病毒 / 环介导等温扩增技术 / Taqman / 检测方法