基于RAA-CRISPR/Cas13a的禽流感病毒检测方法的建立

摘要

对NCBI文库公布的120条不同亚型禽流感病毒的M基因序列进行分析，筛选得到一处高保守片段并进行重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification, RAA)引物和crRNA的设计。待测样品先进行RAA核酸扩增，再将扩增产物转移至有规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas13a检测体系中，通过监测该体系中荧光值的变化情况进行结果判定。使用梯度稀释(10～6～10～0拷贝/μL)的标准阳性质粒以及其他7种禽病病毒验证方法的灵敏度和特异性，并利用本试验所建方法和国标荧光RT-PCR方法对50份临床样品(21份阳性样品、29份阴性样品)进行检测以评价方法的检测性能。结果显示，本试验建立的检测方法灵敏度为10～2拷贝/μL,较普通RAA方法灵敏度提高了2个数量级；能特异性检出AIV,不与NDV、IBV、ILTV、IBDV、ALV、AMPV、AAV-1发生交叉反应；与国标荧光RT-PCR方法相比，该方法检测的特异性、准确性和一致性分别为100%、95.24%和98.00%。结果表明，本试验建立了检测AIV通用型的RAA-CRISPR/Cas13a快速诊断技术，其在37℃条件下60 min内即可完成检测，具有快速、灵敏、特异等优势，为AIV的现场快速检测提供了手段。

关键词

禽流感病毒 / RAA / CRISPR/Cas13a