CRISPR/Cas9介导的HO-1基因敲除细胞系的建立及其应用

摘要

利用CRISPR/Cas9系统构建HO-1基因敲除的猪肾细胞系（PK-15）,为探究HO-1在镉诱导的PK-15细胞铁死亡中的作用及分子机制提供试验材料。设计并合成3条针对HO-1基因的sgRNA,分别连接到慢病毒载体Lenti CRISPRv2上；将构建好的慢病毒质粒转染至人胚胎肾细胞（HEK293FT）,获得重组慢病毒并感染PK-15细胞；经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得HO-1敲除的单克隆细胞系，测序及Western blot验证HO-1基因的敲除情况。用10μmol/L氯化镉（CdCl₂）处理构建好的HO-1基因敲除的细胞，通过CCK-8法检测细胞活力，利用相差显微镜观察细胞形态，采用荧光探针法检测细胞中亚铁离子(Fe²⁺)的含量。结果显示，sgRNA2编辑效率最高，获得的5株敲除细胞HO-1基因均发生了碱基插入或缺失且引起了目的基因的移码，Western blot结果显示未检测到HO-1蛋白表达，表明成功构建了敲除HO-1基因的PK-15细胞系(PK-15^{HO-1 KO})。CdCl₂处理后，与对照细胞相比，PK-15^{HO-1 KO}细胞活力显著升高，Fe²⁺含量显著下降，表明HO-1基因敲除后可以显著缓解镉处理引起的铁代谢异常。综上所述，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了敲除HO-1基因的PK-15细胞系，并证实HO-1在镉处理诱导PK-15细胞铁代谢异常中发挥着重要作用，为后续进一步研究HO-1在镉暴露致PK-15细胞铁死亡的调控机制奠定了基础。

关键词

HO-1 / PK-15 / 基因敲除 / CRISPR/Cas9 / 镉