利用量子点单病毒示踪技术研究水貂肠炎病毒的感染机制

摘要

利用量子点单病毒示踪技术探究水貂肠炎病毒（mink enteritis virus, MEV）在细胞内的感染过程，为MEV的抗病毒治疗提供了潜在靶点。本研究通过生物素-链霉亲和素系统对MEV进行了量子点标记，经TCID₅₀滴度测定和电镜表征后用于感染猫肾细胞（CRFK）。CRFK细胞膜经DiO染色后用量子点标记的MEV进行侵染，利用活细胞工作站系统GE Dleta vision观测病毒进入细胞膜的过程；对CRFK细胞转染pEGFP-Rab5和pEGFP-Rab7载体来标记早期内体和晚期内体，当细胞感染量子点标记的MEV后观测MEV病毒粒子与早期内体和晚期内体的相互作用。为了进一步验证内体与病毒感染的关系，利用氯喹（chloroquine, CQ）和NH₄Cl两种内体酸性抑制剂来抑制内体的酸性环境，对加入抑制剂的感染后的细胞提取细胞内总RNA和蛋白，通过qPCR及Western blot检测细胞内MEV的含量；MEV在胞内的转运与细胞骨架相关，为了探究MEV转运与哪种细胞骨架相关，对CRFK细胞分别转染GFP-lifeact和EGFP-MAP4质粒，经GE Dleta vision观测MEV与细胞骨架的关系。选择微管抑制剂Nocodazole和微丝抑制CytoD剂对感染MEV的CRFK细胞提取细胞内RNA及总蛋白，通过qPCR及Western blot检测细胞内MEV的含量。活细胞成像显示MEV首先附着在细胞膜上，并通过内吞作用进入细胞；成像结果显示MEV与Rab5和Rab7在宿主细胞中共定位，用内体酸化抑制剂NH₄Cl或CQ预处理宿主细胞后，病毒感染被抑制，表明MEV感染需要内体的酸性环境；活细胞图像显示量子点（QD）-MEV沿着微管运动，使用微管抑制剂Nocodazole抑制了病毒感染，而微丝抑制剂CytoD的加入对感染没有影响。研究结果表明，MEV是通过内吞作用进入CRFK细胞膜，随后进入早期内体及晚期内体，在细胞内的转运过程依赖于微管。

关键词

水貂肠炎病毒 / 量子点 / 单病毒示踪 / 侵染机制