pAPN过表达Vero细胞系构建及其对PEDV复制的影响

陈秋勇; 孙志华; 陈如敬; 吴学敏; 吴仁杰; 丘镜莉; 何冰; 刘玉涛; 王隆柏; 周伦江

doi:10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.02.02

中国兽医学报 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (02) : 181 -186. DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.02.02

pAPN过表达Vero细胞系构建及其对PEDV复制的影响

陈秋勇, 孙志华, 陈如敬, 吴学敏, 吴仁杰, 丘镜莉, 何冰, 刘玉涛, 王隆柏, 周伦江

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摘要

猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）是一种锌金属蛋白酶，介导病毒与宿主细胞融合，是冠状病毒的细胞受体之一。为探究pAPN对猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）复制的影响，本研究从小肠组织中扩增出pAPN基因全长，通过限制性内切酶同源位点克隆到慢病毒载体中，获得携带pAPN基因的慢病毒载体PLVX-pAPN-mCMV-ZsGreen1-puro,在293T细胞中包装形成表达pAPN的慢病毒，将慢病毒感染Vero细胞，用嘌呤霉素加压筛选阳性细胞，采用有限稀释法筛选出稳定表达的Vero-pAPN细胞系，并通过测定N基因mRNA转录水平、N蛋白表达水平和TCID₅₀水平差异情况来验证该细胞系对PEDV复制的影响。结果显示，本研究构建的慢病毒能够感染Vero细胞，亚克隆筛选到的单克隆细胞株Vero-pAPN（2C5）能够稳定过表达pAPN;该细胞系能够促进PEDV复制，在12～48 h内N基因mRNA转录水平差异显著（P<0.05）、N蛋白表达水平均提高，TCID₅₀在24和48 h差异显著（P<0.05）。本研究构建了Vero-pAPN细胞系，pAPN在Vero细胞中过表达能够促进PEDV复制，该细胞系可作为疫苗高效生产和临床样本分离的候选细胞系。