猪塞内卡病毒RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法的建立及应用

摘要

建立一种基于逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR Cas13a技术检测猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的快速检测方法。根据猪SVA保守基因序列设计8对RT-RAA引物，筛选最适扩增引物、最佳反应温度、最优RT-RAA反应体系。针对优化的RT-RAA体系设计并筛选最佳CRISPR-derived RNA(crRNA),构建最优RT-RAA-CRISPR反应体系。利用6种常见猪群病原核酸验证已建立方法特异性。用数字PCR标定的SVA cRNA标准品验证已建立方法敏感性。通过重复试验验证方法的稳定性。应用已建立的方法与临床样品进行符合检验。RT-RAA及CRISPR反应体系优化结果显示，RT-RAA反应温度为37℃,扩增效果最佳；从8条crRNA中筛选出crRNA 5检测信号最强。建立的RT-RAA-CRISPR Cas13a方法特异性好，与ASFV、PRRSV、PEDV、PCV2、CSFV、PRV等常见猪群疫病均无交叉反应；方法敏感性高，对SVA最低检测限为0.86 copy/μL;对3个稀释度标准品检测均能稳定产生荧光，重复性好；能够在50 min内完成临床样品检测，对临床检毕的6份阳性样品及58份阴性样品进行符合检测，结果表明检测结果一致，符合率100%。结果表明，本研究建立了一种高特异性、高敏感性的RT-RAA-CRISPR Cas13a检测方法，有望应用于SVA的现场快速检测。

关键词

RT-RAA / CRISPR/Cas13a / SVA