大肠杆菌Nissle 1917 FliC高变区缺失的构建、原核表达及体外TLR5活性检测

摘要

运用生物信息技术分析FliC_EcN的结构和潜在的抗原表位；借助ClonExpress^?同源重组技术设计引物，缺失FliC_EcN高变区不同结构域，并克隆至pET-28a（+）表达载体中表达，经SDS-PAGE和Western blot鉴定鞭毛蛋白变体；采用鲎试剂显色法检测鞭毛蛋白变体中内毒素残留，并使用不同质量浓度的鞭毛蛋白变体刺激Caco-2细胞，通过检测IL-8的分泌水平来评估各鞭毛蛋白变体的生物学活性。生物信息分析结果显示，FliC_EcN高变区的多数结构域被预测为含有潜在的抗原表位；PCR结果显示，fliC_{△820～1 518}、fliC_△736～963、fliC_{△985～1 200}、fliC_△748～828、fliC_{△1 114～1 191}和fliC_{△1 225～1 311}分别约为1 095、1 566、1 578、1 713、1 716、1 707 bp; SDS-PAGE结果显示，经镍柱纯化处理和透析复性的鞭毛蛋白变体分别约为41.36、57.06、57.50、61.97、61.95、61.56 kDa; Western blot结果显示，6个鞭毛蛋白变体均能与抗His单克隆抗体和大肠杆菌H7抗原诊断血清发生特异性反应；TLR5活性检测结果显示，缺失不同结构域的鞭毛蛋白变体保留了其TLR5激动剂功能。结果表明，本试验成功构建了6种FliC_EcN缺失高变区不同结构域的鞭毛蛋白变体，且各鞭毛蛋白变体均保留了其TLR5激动剂功能，展现了良好的生物学特性，为进一步研究鞭毛蛋白在缺失不同结构域后的佐剂效应以及鞭毛蛋白抗体滴度对其佐剂效应影响提供了参考依据。

关键词

大肠杆菌Nissle 1917 / 鞭毛蛋白 / 佐剂 / 原核表达 / TLR5