牦牛源大肠杆菌OmpA外膜蛋白的原核表达及免疫效果评价

摘要

用生物信息学软件将本实验室分离的Escherichia coli QML2206-1(E.coli QML2206-1)株与不同菌种的外膜蛋白A(OmpA)蛋白氨基酸序列进行同源性分析，并对OmpA蛋白进行理化性质分析、跨膜结构和信号肽预测、B细胞抗原表位预测、二级和三级结构预测；将OmpA基因片段与pET-32a载体连接，构建原核表达载体，在BL21(DE3)进行原核表达并优化表达条件后用镍柱亲和纯化系统进行纯化；将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂充分混匀后免疫小鼠，利用ELISA方法检测小鼠特异性IgG抗体水平及小鼠血清中细胞因子CD4、CD8、IL-4的表达水平，并通过小鼠攻毒保护试验评价其免疫保护效果。结果显示，OmpA蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，二级结构主要由无规则卷曲(47.98%)和α-螺旋(29.77%)构成，有12个能与B细胞产生的抗体结合的抗原表位。经原核表达成功获得相对分子质量约为55 kDa的重组蛋白OmpA,且在37℃、IPTG浓度0.000 4 mol/L诱导6 h的表达量最高。重组蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG抗体效价最高可达1∶32 000;与对照组相比，免疫小鼠血清中CD4、CD8及IL-4的表达水平均有升高。用最小致死量(minimum lethal dose, MLD)、2倍最小致死量(2MLD)攻毒后小鼠存活率分别为80%、40%。结果表明，OmpA重组蛋白具有良好的抗原性和一定的免疫保护作用。该研究为下一步基于OmpA蛋白的牦牛适用性E.coli基因工程亚单位疫苗的研制提供了技术依据。

关键词

牦牛源大肠杆菌 / OmpA蛋白 / 原核表达 / 生物信息学分析 / 免疫保护效果