鸭源多杀性巴氏杆菌RPA-LFD检测方法的建立与应用

摘要

根据GenBank上已公布的鸭源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）kmt1基因序列，设计PCR扩增引物，将扩增所得kmt1基因克隆至pMD19-T载体中，构建重组质粒标准品pMD19-T-kmt1,并经PCR和测序鉴定。以pMD19-T-kmt1质粒为模板，kmt1基因为靶基因，设计并合成重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）引物；根据横向流动试纸条（lateral flow dipstick, LFD）要求设计1条探针（Pm-P）,经反应条件优化，建立了检测Pm的RPA-LFD方法，并进行特异性、灵敏性试验，用所建方法对64份临床样品进行检测。结果显示：建立的Pm RPA-LFD方法在37℃15 min即可完成扩增反应；提取鸭源大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、鸭源沙门菌（Salmonella enteriditis,SE）、鸭疫里默杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）、葡萄球菌（Staphylococcus）、鹅细小病毒（goose parvovirus, GPV）、鸭瘟病毒（duck plague virus, DPV）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus, MDPV）的DNA作为模板，以质粒标准品pMD19-T-kmt1为阳性对照进行RPA-LFD,显示除阳性对照外其他均为阴性；将质粒标准品pMD19-T-kmt1进行10倍倍比稀释，以浓度为10～7～10⁰ 拷贝/μL的质粒标准品为模板，检测出敏感度为1.50×10～1拷贝/μL,比PCR方法高100倍。利用PCR、RPA和LAMP-LFD检测64份疑似RA临床样本，3者检出符合率为100%。结果表明，本试验建立的Pm RPA-LFD方法具有特异性强、检测速度快、敏感度高等特点，可应用于Pm的临床样本检测。

关键词

多杀性巴氏杆菌 / kmt1基因 / 重组酶聚合酶扩增 / 横向流动试纸条