基于新吉细毛羊与小尾寒羊血浆源外泌体促毛发再生模型筛选miRNA-mRNA调控靶标

摘要

为探究绵羊血浆外泌体对动物毛发生长作用，通过双相沉淀法提取2种毛细度存在显著差异的新吉细毛羊和小尾寒羊的血浆外泌体，并利用透射电镜和纳米颗粒跟踪(NTA)进行外泌体鉴定；鉴定后建立小鼠斑秃模型，并连续7 d将外泌体注射至小鼠皮下，注射结束后第10天采集背部皮肤样本，通过HE染色观察小鼠皮肤组织学变化；并使用qPCR方法构建miRNA及mRNA文库；借助TargetScan预测差异miRNA的靶基因；使用g:Profiler进行KEGG富集分析并筛选靶基因，并通过STRING对靶基因进行PPI蛋白互作分析筛选出miRNA-mRNA靶标，使用qPCR对靶标进行初步验证。结果显示，在注射外泌体后第5天，小尾寒羊血浆外泌体皮下注射组(SPE)的黑色素沉淀斑点数量多于新吉细毛羊血浆外泌体皮下注射组(XPE),且XPE组的黑色素沉淀斑点数量多于对照组(NC);皮肤组织切片观察发现XPE组毛囊数目相比SPE组和NC组极显著减少(P<0.01),SPE组相比XPE组和NC组毛囊直径极显著增加(P<0.01)。生物信息学分析结果显示，预测到miR-150、miR-133b、miR-31-5p、miR-433-3p、miR-218的靶基因分别为357、711、477、346、3178个；受2个及以上miRNA共同调节的基因有508个。PPI分析显示，217个基因参与细胞过程的正向调节，109个基因参与发育过程的调节，133个基因参与细胞发育过程，132个基因参与细胞分化，69个基因参与细胞分化的调节。并且靶基因通过分泌型糖蛋白受体Wnt上配体与Frizzled受体结合，以及下游钙调蛋白(calmodulin, CaM)和CREB信号通路(cyclic-AMP response binding protein, CREB)基因对毛囊生长进行调控。qPCR表明注射后SPE组和XPE组的miR-218、miR-150、miR-31-5p、miR-133b、miR-433-3p的相对表达量显著高于NC组，且SPE组的表达量显著高于XPE组。qPCR验证得出注射后SPE、XPE组的FZD4、WNT4、CREB1和FZD3的相对表达量均与NC组相比存在显著性差异。结果表明，新吉细毛羊与小尾寒羊血浆外泌体通过改变皮肤中miRNA-mRNA的表达量从而影响毛发生长。

关键词

新吉细毛羊 / 小尾寒羊 / 血浆外泌体 / 毛发生长