间接ELISA检测驴源马冠状病毒抗体方法的建立与应用

摘要

为建立检测驴源马冠状病毒(Equine coronavirus, ECoV)血清抗体的方法，利用大肠杆菌系统表达重组ECoV N蛋白，镍柱亲和层析纯化，蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定其反应原性；将纯化后的重组蛋白作为包被抗原，优化各反应参数，进行敏感性、特异性、重复性试验，建立间接ELISA检测方法，并对143份临床血清样品进行检测。结果显示，重组N蛋白成功获得表达，并与血清抗体具有良好的反应活性；所建立抗体间接ELISA方法最佳条件：抗原包被量为0.2μg/孔，并4℃过夜；10%的脱脂奶粉37℃封闭1.5 h;血清稀释浓度为1∶200,酶标二抗稀释为1∶10 000。敏感性试验结果显示，驴源ECoV阳性血清稀释至6 400倍时结果仍呈阳性；特异性试验结果显示，对多种驴源病原体抗体均为阴性；重复性试验结果显示，批内与批间变异系数分别在2.90%～6.12%与2.29%～7.88%之间。临床血清样品阳性率为57.3%。本研究建立的间接ELISA为开展ECoV流行病学调查、抗体监测等提供了技术支撑。

关键词

驴源马冠状病毒 / 重组N蛋白 / 间接ELISA