基于AAV-SaCas9的猪小肠上皮细胞IRF8基因敲除细胞系的建立

摘要

干扰素调节因子8 (IRF8)在猪肠道天然免疫应答以及抵御肠道病毒感染方面的具体机制仍待研究。为了探究IRF8的免疫调控作用，建立IRF8基因敲除的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)单克隆细胞系具有重要意义。本研究首先通过3质粒共转染HEK-293T细胞获取具有敲除IRF8基因功能的重组腺相关病毒rAAV-sgIRF8-eGFP,然后通过感染IPEC-J2以及流式细胞术的分选，获取有eGFP荧光的IPEC-J2,并培养出单克隆细胞系。再结合Sanger测序以及Western bolt技术对单克隆细胞系进行鉴定。最后利用qPCR方法检测干扰素因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ的表达水平，初步分析IRF8基因对IPEC-J2免疫力的影响。结果表明，成功获取了rAAV-sgIRF8-eGFP并感染IPEC-J2,使其产生eGFP荧光。通过流式细胞术分选并培养出单克隆细胞系IRF8-KO1和IRF8-KO3。Sanger测序显示IRF8-KO1的序列有5个碱基缺失，IRF8-KO3的序列有7个碱基缺失。Western bolt检测显示IRF8-KO1中IRF8蛋白不表达，是理想的候选单克隆细胞系。qPCR对干扰素因子的检测显示，IRF8缺失后，IPEC-J2降低了IFN-γ(P<0.05)和IFN-λ的转录水平(P<0.01);IFN-α和IFN-β的转录水平变化不明显。本研究结果表明成功构建了IRF8基因敲除的IPEC-J2单克隆细胞系，为IRF8相关猪肠道免疫调控和肠道病毒感染机制的研究奠定了基础。

关键词

猪小肠上皮细胞 / 干扰素调节因子8 / CRISPR/Cas9 / 基因敲除