基于RPA-CRISPR/Cas13a-LFD的鸭星状病毒2型快速可视化检测方法的建立

何书海; 陶梦筱; 王露遥; 周德方; 周静; 成子强; 黄立

doi:10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.07.03

中国兽医学报 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (07) : 1372 -1377. DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.07.03

基于RPA-CRISPR/Cas13a-LFD的鸭星状病毒2型快速可视化检测方法的建立

何书海, 陶梦筱, 王露遥, 周德方, 周静, 成子强, 黄立

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摘要

为了实现鸭星状病毒2型(duck astrovirus type 2,DAstV-2)的高效快速检测，根据DAstV-2的ORF2基因保守序列设计合成了RPA引物和crRNA,构建了集RPA核酸扩增、LwCas13a切割和胶体金试纸条可视化显色于一体的DAstV-2检测方法，并评估了该检测方法的灵敏性、特异性和符合性。结果显示，该方法对DAstV-2重组质粒标准品的检测限为1.2×10～1 copies/μL,优于常规RT-PCR方法；可特异性检测DAstV-2病原核酸，对DAstV-1、DAstV-3、DAstV-4、鸭瘟病毒(duck plague virus, DEV)和鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus, DTMUV)无交叉反应；在对疑似DAstV-2感染病鸭肝脏组织样本进行检测时，本方法与实时荧光定量PCR的检测结果完全一致，符合率为100%,但操作更加简便快捷。研究结果表明，所建立的RPA-CRISPR/Cas13a-LFD检测体系灵敏度高、特异性强、准确性高，能够在37℃恒温条件下1 h内完成DAstV-2核酸的快速可视化检测，为DAstV-2的快速诊断提供了新的技术平台。