羔羊睾丸细胞eIF3i基因编码蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与应用

摘要

为制备羊源eIF3i基因编码蛋白的多克隆抗体，本试验利用PCR技术从羔羊睾丸(lamb testicular, LT)细胞中扩增eIF3i基因，并将其克隆至pCold载体，构建pCold-eIF3i质粒，通过质粒PCR、双酶切和序列测定进行验证；将其转化至宿主表达菌BL21(DE3)中，在优化表达条件(IPTG浓度、温度、时间)下诱导eIF3i重组蛋白，利用SDS-PAGE及Western blot检测目的蛋白表达及反应原性；以纯化的eIF3i重组蛋白作为抗原，联合弗氏完全/不完全佐剂免疫新西兰大白兔，经3次免疫后采集血清，采用间接ELISA检测抗血清效价，Western blot分析抗体特异性，间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测抗体应用效果。结果显示，PCR扩增出LT细胞eIF3i基因大小为978 bp; eIF3i重组蛋白的最佳表达条件：IPTG浓度为0.2 mmol/L,温度为37℃,时间为8 h; eIF3i重组蛋白以包涵体形式表达，其大小约为36 kDa;制备的eIF3i蛋白多克隆抗体效价1∶51 200。Western blot和IFA结果显示，制备的eIF3i蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性及特异性。综上所述，本研究成功制备了兔抗eIF3i蛋白多克隆抗体，并证实其能特异性识别内源性eIF3i蛋白，为进一步研究eIF3i蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词

羔羊睾丸细胞 / eIF3i基因 / 原核表达 / 多克隆抗体