SARS-CoV-2的多种Nsp对其聚合酶活性的影响

摘要

通过建立一种基于双顺反子报告质粒及多种非结构蛋白(non-structural proteins, Nsp)质粒的检测系统，以此研究SARS-CoV-2 Nsp对其复制表达的影响。通过分子克隆的方法构建了一种双顺反子报告基因质粒及12种Nsp质粒(包括Nsp3C-Flag、Nsp4、Nsp6～Nsp10、Nsp12～Nsp16),并通过Western blot验证了Nsp的表达。首先，通过将报告质粒只与Nsp12共转染、另添加其辅助因子Nsp7和Nsp8并调整3种Nsp质粒的共转染比例、培养温度及测定时间，以内参基因FLuc荧光素值归一化的NLuc荧光素值判定RNA依赖性RNA聚合酶的活性；并在此基础上调整Nsp9～16共转染的剂量，随后再加入不同剂量的Nsp3C、Nsp4及Nsp6,检测RNA依赖性RNA聚合酶的活性。结果显示，不同比例的Nsp7、Nsp8与Nsp12以1∶8∶24进行共转染时，聚合酶活性显著高于对照组(P<0.001);在此基础上，在Nsp3、Nsp4、Nsp6不参与的条件下，当不添加Nsp9时，添加Nsp10～16可以显著提升RdRp活性(P<0.001);在Nsp3和Nsp4参与的条件下，添加Nsp9时，RdRp活性进一步提升(P<0.05)。结果表明，Nsp9在Nsp3和Nsp4存在的情况下，才可以提高SARS-CoV-2的RdRp活性，Nsp9对病毒复制的促进作用可能是建立在双膜囊泡形成的基础上。

关键词

SARS-CoV-2 / 聚合酶活性报告系统 / 加帽 / DMV