老鹳草通过坏死性凋亡途径改善肝损伤的网络药理学分析和试验验证

摘要

基于网络药理学,通过分子对接与试验验证,探究老鹳草（GWM）在肝损伤治疗中的作用机制。将小鼠随机分为空白组（CON组）、模型组（CCl4组）、药物高剂量组（GWM-H组）与低剂量组（GWM-L组）,利用CC14诱导建立小鼠肝损伤模型,观察肝组织病理形态,测定肝脏炎症因子基因相对表达量。通过TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、Super-PRED、Gene Cards和DisGeNET等数据库获得中药活性成分及中药和疾病靶点信息,将肝损伤、坏死性凋亡及药物三者靶点取交集获得药物潜在作用靶点,使用String数据库对潜在靶点进行蛋白质相互作用（PPI）分析,进一步利用Cytoscape构建“药物-疾病-活性成分-交集靶点”网络图,使用微生信平台对潜在靶点进行GO、KEGG分析。使用MOE软件进行分子对接,最后对分子对接结果进行试验验证,检测关键靶点及RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路相关基因的表达情况。动物试验结果显示,相比于CON组,CCl₄组小鼠肝脏脏器指数显著上升（P<0.05）,小鼠血清AST活性显著上升（P<0.05）,ALT活性极显著升高（P<0.01）,组织病理学检测发现小鼠肝脏肝索紊乱,肝细胞出现严重脂肪变性,并伴有大量肝细胞坏死和炎性细胞浸润的现象。而相比于CCl₄组,GWM-H组小鼠肝脏脏器指数显著下降（P<0.05）,GWM-L组小鼠肝脏脏器指数呈现下降趋势。GWM-H组血清AST活性显著降低（P<0.05）,GWM-L组小鼠血清AST活性呈现下降趋势,GWM-H组血清ALT活性极显著下降（P<0.01）,GWM-L组血清ALT活性显著下降（P<0.05）。组织病理学检测发现药物治疗组均能够改善CCl₄引起的肝损伤,且GWM-H组效果优于GWM-L组。肝脏RT-qPCR结果显示,相比于CON组CCl₄组小鼠肝脏IL-1β和PGE2的mRNA相对表达量极显著升高（P<0.01）,COX2的mRNA相对表达量呈现上升趋势。而相比于CCl₄组,GWM-H组小鼠肝脏IL-1β的mRNA相对表达量极显著降低（P<0.01）,PGE2的mRNA相对表达量显著降低（P<0.05）,COX2的mRNA相对表达量呈现下降趋势。通过网络药理学筛选出GWM缓解坏死性凋亡相关性肝损伤的潜在靶点56个,根据degree值,筛选出排名较靠前的关键靶点包括TNF、Bcl2、HSP90AA1和Caspase 8;关键核心成分为槲皮素、木犀草素、山奈酚以及鞣花酸。GO功能富集分析到2 173个条目,KEGG富集分析到146条生物通路。分子对接结果显示,GWM的主要成分与关键靶点之间的结合能力较强。RT-qPCR试验结果显示,与CON组相比CCl₄组小鼠肝组织TNF-α、TNFR1、MLKL mRNA相对表达量极显著上升（P<0.01）,FAS、RIPK1、RIPK3mRNA相对表达量显著上升（P<0.05）,而Caspase 8 mRNA相对表达量显著下降（P<0.05）。而GWM有效逆转了该趋势,与CCl₄组相比,GWM-H组TNF-α、TNFR1、FAS、MLKL的mRNA相对表达量极显著降低（P<0.01）,RIPK1、RIPK3 mRNA相对表达量显著降低（P<0.05）,Caspase 8的mRNA相对表达量呈现上升趋势。结果表明,GWM通过多成分多途径发挥保肝作用,其中抑制RIPK1/RIPK 3/MLK L通路减少肝细胞坏死性凋亡,可能是其发挥保护作用的重要途径之一。

关键词

老鹳草 / 网络药理学 / 肝损伤 / 坏死性凋亡 / 作用机制