鉴别猪病毒性腹泻病原的四重荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

摘要

为建立一种快速鉴别传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacorona virus, PDCoV）和猪轮状病毒A （porcine rotavirus type A,PoRVA）的四重实时荧光定量RT-PCR方法，本研究从NCBI数据库中分别下载我国流行的PEDV（77株）、TGEV（63株）和PDCoV（19株）的全长序列与85段PoRVA的VP6基因序列并进行同源性分析，基于相对保守序列设计引物和探针。通过筛选最适引物和探针，并对其反应条件和体系进行优化，确定方法的特异性、灵敏度及重复性，同时使用建立的方法对临床样品进行了检测。结果显示，该方法扩增效率高，C_t值与模板数量呈线性相关，R²大于0.99;特异性强，对非洲猪瘟病毒（African swine fever, ASFV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）和伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）等主要猪群病原的核酸无检出；敏感性强，针对TGEV、PEDV、PDCoV和PoRVA的检测极限分别为10、20、20和50拷贝/μL;重复性好，组内和组间重复性检测变异系数均<1%。用建立的方法对109份腹泻样品进行检测，与行业标准检测结果进行比较，符合率为100%,具有较高的实用性。本研究建立的一种鉴别猪病毒性腹泻病原的四重实时荧光定量RT-PCR方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性和稳定性好等优点，适用于病毒诊断和批量临床样品检测，为疾病防控、流行病学调查提供了技术支撑。

关键词

传染性胃肠炎病毒 / 猪流行性腹泻病毒 / 猪德尔塔冠状病毒 / 猪轮状病毒A / 四重实时定量荧光RT-PCR