检测猪痘病毒微滴数字PCR方法的建立和应用

摘要

为建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪痘病毒(swinepox virus, SWPV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的定量检测方法，本研究采用SWPV的TK1基因作为本研究的靶基因，通过反应体系优化，确定ddPCR的退火温度、引物和探针浓度；并对ddPCR方法的敏感性、特异性、重复性进行了确定，同时对临床样本进行了检测。结果显示，建立的ddPCR方法的最佳退火温度为58℃,最佳的引物和探针浓度分别为700和300 nmol/L。敏感性试验结果显示，在动态范围内ddPCR方法的最低检测限为6.03拷贝/反应，显著高于行业标准中qPCR方法(131拷贝/反应);特异性结果显示，ddPCR方法与猪塞内卡病毒、猪伪狂犬病病毒等7种病毒核酸均无非特异性反应；重复性结果显示，批间与批内变异系数均小于10%,具有可重复性。以建立的ddPCR法和现有行标qPCR法平行对216份临床样品进行了SWPV核酸检测，ddPCR方法阳性检出率(10.18%)高于qPCR (6.01%)。本研究建立的SWPV ddPCR检测方法具有特异、敏感等优点，可用于SWPV的定量检测。

关键词

猪痘病毒 / 微滴式数字PCR / 定量检测方法