基于Nanopore测序技术的非洲猪瘟Ⅰ/Ⅱ重组型和Ⅱ型全基因组测序方法的建立

摘要

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病，能够感染家猪和野猪，并对全球经济及养猪业的健康发展构成严重威胁。近几年，我国流行ASFV毒株基因组也发生着一系列的缺失/重组等变异，为了解临床ASFV流行情况，本研究通过Nanopore三代测序技术建立一种ASFV二型和重组型全基因组测序方法。以基因Ⅰ型(Pig/SD/DY-1/2021)、基因Ⅱ型(HLJPig/HLJ/18)及重组型毒株Pig/jiangsu/LG/2021为参考毒株，设计32对引物并分为8个引物池对样本进行多重PCR(multiplex polymerase chain reaction, mPCR),利用Nanopore测序技术对扩增产物进行测序，对得到的测序结果进行生物信息数据分析，建立了ASFV二型毒株和重组型毒株全基因组测序方法。应用该方法成功从淋巴结样本中获取2个毒株全基因组，ASFV重组型毒株China-HN-6和Ⅱ型毒株China-HN-5拼接后的基因组大小分别为185 094和189 107 bp,且China-HN-6和China-HN-5平均测序深度分别为574×和828×,China-HN-6与PIG/Jiangsu/LG/2021参考基因组相比，基因组变异为0.014 0%,其中缺失占0.006 5%、插入占0.001 6%、单核苷酸变异占0.005 9%;China-HN-5与Pig/HLJ/18参考基因组相比，基因组变异为0.013 0%,其中缺失占0.003 7%、插入占0.003 2%、单核苷酸变异占0.006 4%。经一代测序验证表明，在B646L、CD2V和CVR等关键基因及部分随机选取变异位点上，此方法结果与一代测序结果100%一致。此外，该研究中还发现了ASFV重组型毒株在B602L基因区间存在56 bp重复序列的插入(通过一代测序技术进行了验证)。研究成功建立了基于纳米孔测序平台的ASFV重组型毒株和Ⅱ型毒株全基因组测序方法，该方法具有良好的简便性和可靠性，为当前ASF的防控和分子流行病学研究提供了一个重要手段。

关键词

Nanopore测序 / 非洲猪瘟病毒 / 生物信息学分析