牛冠状病毒体外感染牛小肠上皮原代细胞模型的建立

摘要

为建立牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)体外感染的牛小肠上皮细胞(bovine intestinal epithelial cell, BIEC)模型，本研究无菌分离未食初乳的健康新生犊牛十二指肠细胞，通过相差贴壁法纯化上皮细胞，并利用间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测上皮细胞标志物角蛋白CK-18的表达以确认细胞纯度。同时，以1MOI的BCoV感染纯化后的BIEC,利用IFA、Western blot和RT-qPCR等方法分别检测BIEC对BCoV的易感性、病毒感染细胞不同时间点的BCoV N蛋白表达及病毒生长曲线。结果显示，分离出肠上皮细胞形态均一，呈鹅卵石样或砖块样；IFA检测结果显示，细胞表达上皮细胞分子标记物CK-18。BIEC感染BCoV后呈现可见的“拉网”状细胞病变，IFA检测到BCoV N蛋白的表达，Western blot试验结果显示，BIEC细胞感染BCoV后6～24 h的BCoV N蛋白表达量随感染时间延长显著上升(P<0.05);RT-qPCR显示病毒载量于感染后48 h达到峰值，随后下降并趋于平稳。结果表明，本研究成功建立了BCoV感染的BIEC体外模型，证实了BIEC对BCoV的易感性，为BCoV的致病机制研究和抗病毒药物开发提供了重要试验平台和技术基础。

关键词

牛冠状病毒 / 牛小肠上皮细胞 / 病毒感染模型