牛疱疹病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

程悦宁; 王振军; 曹泽昭; 王春霞; 吴丹妮; 李响; 张海丽; 闫曼平; 张竞; 关继羽

doi:10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.12.07

中国兽医学报 ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (12) : 2630 -2637. DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2025.12.07

牛疱疹病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

程悦宁, 王振军, 曹泽昭, 王春霞, 吴丹妮, 李响, 张海丽, 闫曼平, 张竞, 关继羽

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摘要

为了建立一种快速、灵敏的牛疱疹病毒4型（bovine herpesvirus 4,BoHV-4）SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）检测技术，依据BoHV-4的基因组序列，设计与优化引物浓度和退火温度，并以此建立了检测BoHV-4的qPCR方法以及确定方法的灵敏度、特异性及重复性。结果显示，优化后qPCR体系的最佳引物浓度为400 nmol/L,最佳退火温度为60℃;标准曲线为y=-3.680x+39.323,R²=0.999 1;该方法的最低检测下限为37.5 copies/μL,可在70 min内完成样本检测；组内重复变异系数（coefficient of variation,Cv）值小于2%;组间重复Cv值小于3%;特异性试验证实，该方法对牛疱疹病毒1型（bovine parainfluenza virus 1,BoHV-1）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus 3,BPIV-3）无交叉反应；采用建立的qPCR和PCR方法对118份牛眼鼻拭子、阴道分泌物拭子、粪拭子、血液等（其中BoHV-4阳性样品25份）样品进行检测，检测结果与临床检测结果相符。本研究建立的BoHV-4 SYBR GreenⅠqPCR检测方法具有高灵敏度、强特异性和良好重复性，为牛群健康监测和疾病防控提供了有力工具。