梭杆菌实时荧光定量PCR方法的建立及其与犊牛腹泻的相关性分析

摘要

梭杆菌属是一类专性厌氧革兰阴性杆菌，其在新生犊牛肠道内丰度的显著变化与犊牛腹泻的发生发展紧密相关。准确评估犊牛肠道梭杆菌的丰度可为阐明该微生物与犊牛腹泻的互作机制奠定方法学基础。本研究旨在建立一种针对犊牛肠道梭杆菌的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测方法，并探讨其与犊牛腹泻及相关病原感染的临床相关性。基于GenBank中梭杆菌16S rRNA基因序列，设计梭杆菌属特异性引物rob-F/R。构建重组质粒pMD^TM19-T-FUS作为标准品，优化反应体系，并系统验证方法的特异性、灵敏度及重复性。利用该方法检测330份犊牛临床粪便样本，结合粪便评分、日龄阶段及病原感染类型，分析犊牛肠道梭杆菌丰度的变化及其临床相关性。结果显示，本研究建立的方法特异性强，仅对梭杆菌属细菌产生扩增，对近缘物种和其他常见犊牛肠道细菌无特异性信号；灵敏度达2.74×10～2 copies/μL,批内和批间变异系数分别为0.14%～0.15%和0.11%～0.31%,梭杆菌检出率显著优于普通PCR（检出率82.7%比41.8%）。临床分析表明，腹泻组梭杆菌生物量极显著高于未腹泻组（P<0.01）,且8～14日龄犊牛梭杆菌丰度达峰值，与腹泻高发期吻合；隐孢子虫单一感染组和牛轮状病毒单一感染组梭杆菌生物量显著高于健康组（P<0.05）,且其丰度与腹泻严重程度呈正相关（评分3分组，与健康组相比，P<0.01）。本研究建立了犊牛梭杆菌属的高效RT-qPCR检测技术，证实梭杆菌丰度升高与犊牛腹泻及隐孢子虫感染密切相关，为犊牛肠道梭杆菌的检测及梭杆菌与宿主间的互作机制研究提供了可靠工具。

关键词

梭杆菌属 / 实时荧光PCR / 犊牛腹泻 / 隐孢子虫感染