微小隐孢子虫PPI蛋白分子特性及抗PPI血清抗虫效果检测

摘要

对微小隐孢子虫肽基-脯氨酰顺反异构酶(Cryptosporidium parvum peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, CpPPI)进行生物信息学分析、原核表达与鉴定，探究该蛋白分泌特性、转录规律、亚细胞定位等分子特性，并通过抗体阻断试验探究其作为药物靶点的潜力。通过原核表达获得具有GST标签的重组蛋白rCpPPI,进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。纯化的rCpPPI经3次皮下注射免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，ELISA检测血清效价，Western blot验证血清对天然和重组CpPPI的识别。利用ELISA检测子孢子脱囊后不同时期排泄分泌产物中CpPPI蛋白含量，qPCR检测CpPPI在虫体发育不同时期的转录水平，IFA观察CpPPI在虫体中的亚细胞定位等分子特性。抗血清孵育子孢子并侵入HCT-8细胞，qPCR检测荷虫量和炎症因子水平，Western blot检测HCT-8细胞肠道屏障蛋白表达水平。结果显示，双酶切和测序证明重组质粒pGEX-4T-PPI构建成功。SDS-PAGE和Western blot验证带有GST标签的rCpPPI成功表达，相对分子质量约45 kDa。免疫小鼠制备的多抗能够识别天然CpPPI与rCpPPI。ELISA显示CpPPI存在于子孢子排泄分泌产物中，qPCR显示虫体入侵宿主细胞3 h左右CpPPI转录水平最高，IFA显示CpPPI在子孢子细胞质中、脱囊过程中及脱囊后的卵囊内壁上均有存在。抗血清孵育能够降低微小隐孢子虫在HCT-8细胞中的增殖和致病力，荷虫量降低约为对照组54%,炎症因子水平、肠道屏障相关蛋白表达量有所恢复。综上，CpPPI是一种亲环蛋白型肽基-脯氨酰顺反异构酶，主要位于子孢子细胞质但能够被分泌，抗体阻断试验表明CpPPI具有作为药物靶点的潜力，为该蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词

微小隐孢子虫 / 肽基-脯氨酰顺反异构酶 / 原核表达 / 药物靶点