二硫键形成蛋白DsbA介导单增李斯特菌氧化应激耐受的机制

摘要

利用定点突变技术构建DsbA P37F38二硫键形成蛋白DsbA关键活性基序CPFC中2个半胱氨酸(Cys)中间氨基酸P37F38位点突变蛋白原核表达株，通过酶促动力学曲线检测DsbA蛋白还原酶活性；利用Overlap PCR及同源重组策略构建单增李斯特菌dsbA P37F38位点突变菌株，通过生长曲线试验检测DsbA关键活性基序中P37F38位点对单增李斯特菌抗氧化应激能力的影响。利用RT-qPCR探究dsbA缺失后其余含有CXXC位点的基因以及应激转录调控基因sigB转录水平变化，检测dsbA缺失对其转录水平的影响；通过Western blot试验检测dsbA缺失对SigB蛋白表达的影响。结果显示，P37F38是二硫键形成蛋白DsbA酶活功能表达的关键氨基酸位点，该位点突变后能够显著降低DsbA蛋白对氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原酶活性(P<0.001);P37F38位点突变菌株在肼(diamide)应激条件下的生长能力显著增强(P<0.001);同时，ΔdsbA菌株中SigB的表达水平显著低于野生株(P<0.001)。综上，本研究证实DsbA的P37F38氨基酸位点能够显著地影响DsbA对不同底物的还原酶活性以及细菌对肼应激的耐受性，DsbA缺失造成SigB表达量减少进而减弱单增李斯特菌在氧化应激压力下的生长；并进一步解析了单增李斯特菌硫氧还蛋白关键氨基酸位点及其生物学功能，为单增李斯特菌的防控及抗感染治疗提供更多潜在靶标。

关键词

单增李斯特菌 / 二硫键形成蛋白 / 关键活性位点CXXC / 氧化应激耐受 / SigB