传染性支气管炎病毒疫苗株4/91反向遗传系统的建立与表达传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组IBV 4/91株的构建与鉴定

摘要

为了研制防控鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)混合感染的二联弱毒活疫苗，本研究构建了IBV疫苗株4/91的反向遗传系统。利用反转录PCR扩增涵盖IBV 4/91株基因组的9个相互重叠的片段，将扩增的9个片段与带有IBV基因组两端同源臂、巨细胞病毒(CMV)启动子、丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRz)和牛生长激素(BGH)多聚A(polyA)等序列元件的细菌人工染色体(BAC)载体通过环形聚合酶延伸反应组装成含有IBV全长基因组cDNA的感染性克隆pBAC-4/91。为了验证所建立的反向遗传平台的功能，将带有IBV N基因转录调控序列(TRS)的绿色荧光蛋白ZsGreen基因插入到pBAC-4/91中病毒基因组中N基因下游，获得重组感染性克隆pBAC-4/91-ZsGreen。将pBAC-4/91-ZsGreen与表达IBV N蛋白的辅助质粒pCI-neo-N共转染BHK-21细胞，拯救出表达绿色荧光蛋白的重组病毒rIBV-4/91-ZsGreen。病毒拯救结果显示IBV 4/91疫苗株的反向遗传技术平台被成功建立。在此基础上，将pBAC-4/91-ZsGreen中的ZsGreen基因替换为ILTV的糖蛋白D(gD)基因，构建表达ILTV gD基因的重组IBV 4/91株，rIBV-4/91-gD/ILTV。PCR检测结果显示ILTV gD基因可以在重组病毒基因组中稳定存在，Western blot显示重组rIBV-4/91-gD/ILTV可以稳定表达gD蛋白，表明重组病毒具有良好的遗传稳定性。病毒在鸡胚中的复制动态显示，rIBV-4/91-gD/ILTV与亲本IBV毒株具有相似的复制能力。本研究构建的重组病毒rIBV-4/91-gD/ILTV为研发防控鸡传染性支气管炎和传染性喉气管炎的二联活疫苗奠定了基础。

关键词

传染性支气管炎病毒 / 反向遗传平台 / 传染性喉气管炎病毒 / 糖蛋白D / 二联活疫苗