利用CRISPR/Cas9技术构建表达神经生长因子的BoHV-1重组病毒

其根; 刘春羽; 张杨; 蔺冰冰; 赵洪哲; 刘闯; 邹健; 王凤雪; 温永俊

doi:10.16303/j.cnki.1005-4545.2026.02.17

中国兽医学报 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (2) : 366 -375. DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2026.02.17

利用CRISPR/Cas9技术构建表达神经生长因子的BoHV-1重组病毒

其根, 刘春羽, 张杨, 蔺冰冰, 赵洪哲, 刘闯, 邹健, 王凤雪, 温永俊

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摘要

为探究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建重组病毒BoHV-1ΔgE/NGF mCherry⁺的可行性和重组病毒的生长特性及蛋白表达情况，本研究基于生物信息学分析预测并优化NGF蛋白序列后，采用酶切连接法将其与BoHV-1的左右同源臂片段连接，构建供体质粒pCDNA3.1-LgE-NGF-mCherry-RgE。将该质粒与CRISPR/Cas9切割质粒pX459 EGFP sgRNA1和pX459 EGFP sgRNA2共转染至Vero E6细胞，并感染BoHV-1ΔgE/EGFP⁺,通过倒置荧光显微镜筛选获得重组病毒BoHV-1ΔgE/NGF mCherry⁺。同时，以PCR和RT-PCR方法验证基因整合与转录情况，利用蚀斑克隆和病毒滴定法分析病毒增殖特性，并采用Western blot检测蛋白表达水平。结果显示，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功将NGF-mCherry片段插入BoHV-1 gE基因位点，进一步对拯救出的重组病毒BoHV-1ΔgE/NGF mCherry⁺鉴定，结果显示整合到重组病毒BoHV-1ΔgE/NGF mCherry⁺中的NGF基因能够转录与表达出大小为37 kDa目的条带，该重组病毒与BoHV-1ΔgE/EGFP⁺的病毒滴度相近，但蚀斑形态存在差异，病毒复制能力无显著性差异。上述结果为BoHV-1作为神经退行性疾病治疗的病毒递送工具奠定了基础。