PoRV和PEDV双重荧光RAA检测方法的建立与初步应用

摘要

为建立可同步快速检测猪轮状病毒(PoRV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重实时荧光重组酶介导等温扩增方法(RF-RAA),选取PoRV的NSP4基因及PEDV的M基因保守区域为检测靶标，构建串联重组质粒pUC57-NSP4-M,并设计合成特异性引物和探针。通过实时检测荧光信号，优化反应条件，建立双重RF-RAA检测方法，并对其特异性、敏感性及重复性进行系统评价。进一步应用该方法对临床腹泻样品进行检测，并与国家标准RT-PCR方法(GB/T 36871-2018)进行比较，分析两者检测结果的符合率。结果显示，成功建立了双重RF-RAA检测方法，在42℃恒温条件下反应20 min即可完成检测。敏感性试验结果表明，该方法对PoRV和PEDV检测限均达到10～1拷贝/μL;特异性结果显示，该方法与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)等常见猪腹泻病原体核酸检测无交叉反应。利用所建立的双重RF-RAA与国家标准RT-PCR方法分别检测140份猪粪便样品，2种方法检出的PoRV阳性率均为13.57%(19/140),PEDV阳性率为10.71%(15/140),PoRV/PEDV混合感染阳性率为33.57%(47/140),且所有阳性样本检测结果100%符合。结果表明，本研究成功建立了灵敏、特异和快速的双重RF-RAA检测方法，为临床上PoRV与PEDV混合感染的检测提供了技术支撑。

关键词

猪轮状病毒 / 猪流行性腹泻病毒 / 快速检测 / 荧光重组酶介导等温扩增方法