基于TaqMan探针的羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及安徽省部分地市流行毒株VIR基因的遗传变异分析

摘要

为建立羊口疮病毒(ORFV)快速准确的检测方法，并明确安徽省主要肉羊养殖区流行毒株的遗传演化特征，本研究构建了一种TaqMan实时荧光定量PCR方法，对采自安徽省重点养羊地区的303份临床样本进行检测；同时通过PCR扩增阳性样品中ORFV的全长VIR基因，并进行测序与遗传变异分析。结果显示，所建立的实时荧光定量PCR方法可在约30 min内完成检测，对ORFV基因组DNA的检测下限为4.28拷贝/μL,且与其他5种常见病毒核酸无交叉反应，批内和批间扩增变异系数(Cv)均低于1.33%。临床样本检测结果显示，ORFV阳性率为48.84%(148/303)。对阳性样本中的ORFV全长VIR基因进行常规PCR扩增，获得64条完整的VIR基因DNA序列(山羊源33条，绵羊源31条)。序列分析显示，64条样本毒株VIR基因DNA及其氨基酸序列的同源性分别为95.1%～100%和92.4%～100%。其中，33条山羊源毒株VIR基因DNA与氨基酸序列的同源性分别为95.1%～100%和92.4%～100%,其氨基酸突变位点主要位于Q24H、S101A、S124P和A154T等处。31条绵羊源毒株VIR基因DNA与氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%,其氨基酸突变位点主要分布于R14S、D17G、D47N、M97L、M103I、H122R、K135E、L140R、A154V和A169T等处。进化树分析显示，33条山羊源毒株(Group 1)与31条绵羊源毒株(Group 2)分别位于遗传距离较远的两大分支。其中，山羊源毒株与我国山西、台湾、云南、吉林、福建和陕西山羊参考毒株亲缘关系较近；绵羊源毒株则与新疆、河南、甘肃和广西绵羊参考毒株亲缘关系较近。本研究建立了一种可快速检测ORFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法，并揭示安徽省山羊源与绵羊源ORFV毒株VIR基因具有不同的突变模式且存在显著的遗传差异，为该病的防控提供了科学依据。

关键词

羊口疮病毒 / TaqMan探针 / 荧光定量PCR / VIR基因