产气荚膜梭菌α毒素和ε毒素体外融合蛋白的制备与免疫评价

摘要

旨在利用SpyTag/SpyCatcher偶联技术制备产气荚膜梭菌α、ε毒素体外融合蛋白α-ε,并比较其与单一α、ε毒素免疫的免疫效果。通过Overlap PCR技术获得携带有SpyTag序列的α毒素（D56G、H68G）基因片段αST与携带SpyCatcher序列的ε毒素（H106P）基因片段εSC。将片段αST、εSC分别克隆至pET-28α与pColdⅡ载体中得到重组表达质粒pET-αST、pCold-εSC;将两质粒分别转化E.coliBL21（DE3）后诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定，并通过镍离子亲和层析进行纯化，获得αST和εSC蛋白。将两者进行体外对接，获得体外融合蛋白α-ε。将αST、εSC蛋白和α-ε融合蛋白分别与水佐剂混合后免疫小鼠。首免后每7 d采集血清，使用ELISA方法检测抗体水平，并检测一免、二免后21 d血清的中和效价；二免后21 d分离脾细胞，检测T细胞亚群。结果显示，αST和εSC蛋白均以可溶性和包涵体两种形式表达，以可溶性为主。α-ε融合蛋白组能更快地产生较高水平的IgG抗体并刺激机体产生中和抗体；二免后21 d, α-ε组血清中和效价（256倍）显著高于αST组（64倍，P<0.05）;α-ε组血清中和效价（2 048倍）显著高于εSC组（128倍，P<0.05）。流式细胞术检测显示α-ε组产生了较高比例的记忆性CD8⁺T细胞。结果表明，本研究利用SpyTag/Spy Catcher偶联技术成功制备了融合蛋白α-ε,其能同时有效刺激机体体液免疫和细胞免疫，为产气荚膜梭菌亚单位疫苗的开发提供了新策略。

关键词

产气荚膜梭菌 / α毒素 / ε毒素 / 纳米颗粒 / 免疫原性