猪流行性腹泻病毒反向遗传系统的构建

黎鑫; 吴倚婉; 陈桂娥; 颜志斌; 李冰洁; 彭津; 李根; 罗均; 郭霄峰

doi:10.16303/j.cnki.1005-4545.2026.06.02

中国兽医学报 ›› 2026, Vol. 46 ›› Issue (6) : 1200 -1209. DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2026.06.02

猪流行性腹泻病毒反向遗传系统的构建

黎鑫, 吴倚婉, 陈桂娥, 颜志斌, 李冰洁, 彭津, 李根, 罗均, 郭霄峰

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摘要

为构建猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染性克隆，进而为解析该病毒尤其当前流行的GⅡ型毒株的基因组复制机制、关键毒力基因功能提供可控的分子工具，本研究根据PEDV CH/GDZH02/1401株基因组反转录的cDNA序列PCR扩增得到9段基因组片段，通过In-Fusion无缝克隆技术将各基因组片段分别与pcDNA3.1质粒进行连接，获得中间质粒pcDNA3.1-PEDV-1～pcDNA3.1-PEDV-9。其中，在构建pcDNA3.1-PEDV-1和pcDNA3.1-PEDV-9前先对质粒pcDNA3.1进行修饰，在质粒pcDNA3.1中依次插入CMV启动子、锤头状核酶序列和PEDV第1段序列构建pcDNA3.1-PEDV-1,在质粒pcDNA3.1依次插入PEDV第9段序列、丁型肝炎核酶和BGH终止子序列，构建pcDNA3.1-PEDV-9。以9个中间质粒为模板，设计9对引物扩增包含至少35 bp同源臂的DNA片段，并将其与酵母载体pYES1L转化到MaV203酵母感受态细胞中，设计检测引物筛选含有pYES1L-PEDV的酵母菌菌落。裂解获得的阳性酵母菌落，电转化至DH10B大肠杆菌中，经PCR鉴定筛选阳性菌落后，提取质粒获得pYES1L-PEDV。将其与辅助质粒pCAGGS-PEDV-N共转染至BHK-21细胞，48 h后收集细胞上清液，将其接种至Vero细胞，通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)以及Western blot进行鉴定。结果显示，Vero细胞接种PEDV病毒液后48 h出现明显细胞病变，IFA结果显示感染细胞出现绿色特异荧光信号，表明成功拯救出rPEDV。Western blot结果显示，rPEDV在Vero细胞进行连续传代后(15代),其感染细胞中仍然可检测到58 kDa的N蛋白。病毒的生物学特性试验结果显示，rPEDV的TCID50、生长曲线与亲本株无明显区别。结果表明，本试验成功构建了PEDV全基因组感染性克隆，并成功拯救出rPEDV,为后续PEDV基因功能的研究和新型疫苗的研发奠定了基础。