猪传染性胃肠炎病毒RT-RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立

摘要

本研究建立1种针对猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)高特异性、高灵敏度且便捷快速的检测方法。结合逆转录-重组酶聚合酶等温扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RAA)及CRISPR/Cas13a技术检测TGEV,根据猪TGEV保守基因序列设计RT-RAA引物，优化反应条件。针对优化的RT-RAA体系设计并筛选最佳CRISPR-derived RNA(crRNA),构建最优RT-RAA-CRISPR/Cas13a反应体系。应用已建立的方法对模拟临床样品进行符合性检验。经试验表明，建立的RT-RAA-CRISPR/Cas13a方法特异性好，与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病病毒(PEDV)等常见猪病毒病原均无交叉反应；方法敏感性高，对TGEV最低检测限为9.657拷贝/μL;对3个稀释度标准品检测均能稳定产生荧光，重复性好；通过模拟临床样品验证该方法，其符合率为100%。检测结果可通过荧光仪或侧向流试纸条(LFD)实现可视化。结果表明，本研究建立的RT-RAA-CRISPR/Cas13a检测方法可快速检测TGEV,为现场诊断和防控提供了有力的技术保障。

关键词

RT-RAA / CRISPR/Cas13a / TGEV / 快速检测方法

基金资助

中国动物卫生与流行病学中心科技创新基金资助项目(DW2022003)