鉴别羊5种病原的多重荧光RT-PCR方法的建立及初步应用

摘要

本研究建立了一种基于一步法多重荧光逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术的检测体系，可实现对边界病病毒（BDV）、布鲁菌（Bru）、弓形虫（T.gondii）、流产衣原体（C.abortus）及山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）的同步检测与病原鉴别。其最低检测限（LOD）低于10 copies/μL,且在临床检验中表现出100%的特异性，未见交叉反应或假阳性现象。精密度和重复性测试显示，对于10⁵和10³ copies/μL的混合质粒，各靶标的变异系数（Cv）均小于1%,极差值小于1,重复性良好。单重荧光RT-PCR检测方法与多重荧光RT-PCR检测方法的相关系数R²均大于0.996,扩增效率E值均在90%～100%之间。对临床已知感染状态的核酸样品检测结果100%符合。分别从感染背景未知羊的200份鼻拭子、200份粪拭子和100份组织样本中筛查到Bru阳性样品55份、CAEV阳性样品5份、T.gondii阳性样品5份和C.abortus阳性样品2份，其中2份粪拭子样品存在CAEV和T.gondii混合感染情况。经系统性试验验证及临床样本评估，本研究构建的多重荧光RT-PCR检测体系展现出卓越的检测效能，其灵敏度、特异性及重复性均达到临床诊断标准。该方法可同步鉴别边界病病毒、布鲁菌、弓形虫、流产热衣原体及山羊关节炎脑炎病毒5种病原体，为临床大规模筛查中多重病原混合感染的快速精准鉴定提供了高效技术方案。

关键词

多重实时荧光RT-PCR / 边界病病毒 / 布鲁菌 / 弓形虫 / 流产衣原体 / 山羊关节炎脑炎病毒 / 混合感染

基金资助

十四五国家重点研发计划资助项目(2022YFD1800705)