猪德尔塔冠状病毒特异性纳米抗体的筛选及鉴定

摘要

猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）感染是一种由PDCoV引起的新型肠道传染病，临床表现为水样腹泻和呕吐。传统ELISA技术通常采用多克隆或单克隆抗体作为检测试剂，这类抗体分子量较大，对抗原表位的空间可及性较低，且在酸碱环境中稳定性较差，因而在需要快速检测的场景中应用受限。纳米抗体（nanobodies, Nbs）源自驼科动物重链抗体的可变区域，兼具体型微小、结构稳固、特异性突出与亲和力优异的特质。本研究旨在研制PDCoV的Nbs,使用PDCoV RBD二聚体对羊驼进行5次免疫，采集羊驼外周血分离淋巴细胞，提取总RNA,以cDNA为模板通过PCR扩增Nbs基因，分别酶切Nbs基因片段与载体pComb3XSS,将目的基因片段与载体pComb3XSS连接，并将连接产物电转至ER2738感受态细胞中，以此获得Nbs初始文库。经测定该库容约为6.75×10⁹ CFU/mL,通过辅助噬菌体M13KO7救援获得噬菌体展示纳米文库，经鉴定库容为9.0×10¹³ PFU/mL,Nbs基因插入率为100%。通过4轮固相筛选，通过优化淘选条件，噬菌体洗脱量逐轮增加，其Nbs噬菌体在第二轮输出明显富集，富集率为191倍；挑取单克隆，进行Phage-ELISA鉴定，从中筛选出30株阳性克隆，将这些阳性克隆送至生物公司测序，结果显示，均为同一氨基酸序列，将其命名为HNb-01。将该Nbs进行原核表达，经Western blot、ELISA和IFA验证均可以特异性结合PDCoV RBD二聚体。本研究结果为开发Nbs的PDCoV RBD二聚体快速检测方法奠定了基础。

关键词

PDCoV / PDCoV RBD二聚体 / 噬菌体展示文库 / Nbs

基金资助

“十四五”国家重点研发项目(2022YFD1300704)