吡非尼酮对肝缺血再灌注损伤的影响及其与ALOX12通路的关系

China Journal of General Surgery, 2024, 33(11):1935-1940.

摘要

背景与目的 肝缺血再灌注损伤（HIRI）是肝切除术和肝移植术后常见的并发症，严重影响术后恢复并可能导致多器官功能障碍综合征。研究显示，吡非尼酮在多种器官中具有抗缺血再灌注损伤作用。因此，本研究在细胞与动物模型上观察吡非尼酮抗HIRI的作用，并分析其作用与ALOX12通路的关系。 方法 用正常肝细胞系构建缺氧/复氧模型，以无处理的正常肝细胞系为对照，观察吡非尼酮预处理对缺氧/复氧肝细胞炎症因子释放以及ALOX12蛋白表达的影响；用小鼠构建HIRI模型，以假手术小鼠为对照，观察吡非尼酮预处理对小鼠肝脏的保护作用以及对肝组织ALOX12蛋白表达的影响。 结果 细胞实验结果显示，吡非尼酮预处理后，肝细胞由缺氧/复氧引起的各炎症因子释放被明显抑制，且肝细胞中ALOX12蛋白的表达明显下调（均P<0.05）。动物实验结果显示，吡非尼酮预处理后，由缺血再灌注引起的肝组织损伤与肝功能损伤明显减轻，以及由缺血再灌注诱导的肝组织ALOX12蛋白表达上调被明显抑制（均P<0.05）。 结论 吡非尼酮具有抗HIRI作用，其机制部分可能与下调ALOX12表达有关。

Graphical abstract

关键词

肝切除术 / 再灌注损伤 / 吡非尼酮 / 花生四烯酸12-脂氧合酶

肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝切除术、肝移植术后等临床过程中常见的并发症，其主要特征是肝细胞因缺血及再灌注过程中的双重打击而产生的氧化应激、炎症反应、凋亡及坏死等病理过程^[1]。HIRI不仅影响患者术后恢复，还可能导致多器官功能障碍综合征，是肝脏外科手术面临的重要挑战之一^[2]。

吡非尼酮（pirfenidone）是一种具有抗纤维化及抗炎作用的药物，近年来在多种器官的缺血再灌注损伤中均表现出显著的保护作用^[3-6]。研究^[3-7]显示，吡非尼酮在肝脏、肾脏、肺部和脑部的缺血再灌注模型中，能够通过抑制促炎因子[如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）]的表达，减少炎症反应，降低氧化应激水平，最终改善组织损伤。此外，吡非尼酮还能够抑制纤维化相关基因的表达，调控细胞内钙离子稳态，从而在抑制肝细胞凋亡和坏死过程中发挥重要作用。

研究^[1,8-9]表明，ALOX12-12-HETE-GPR31信号通路在HIRI过程中发挥着关键作用。ALOX12是催化花生四烯酸生成12-羟基-5，8，10，14-二十碳四烯酸（12-HETE）的重要酶，12-HETE进一步与G蛋白偶联受体31（GPR31）结合，激活下游的信号传导，从而导致炎症因子释放、氧化应激加剧和肝细胞凋亡，通过敲除ALOX12、12-HETE、GPR31基因可以有效抑制这些病理过程，减轻肝脏的缺血再灌注损伤。

对于HIRI，吡非尼酮可能通过多层面的调控发挥保护作用。首先，吡非尼酮通过减少氧化应激产物丙二醛的生成，增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶的活性，减轻氧化应激对肝细胞的损伤。其次，吡非尼酮通过抑制炎症介质的释放，从而抑制炎症反应，减少对肝组织的进一步损害^[10]。本研究在细胞模型及小鼠模型上进一步观察吡非尼酮抗HIRI作用，并分析其作用与ALOX12通路的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

吡非尼酮购自MCE有限公司；高糖DMEM购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Gibco公司；RIPA裂解液购自Beyotime Biotech公司；SDS-PAGE凝胶配胶试剂盒购自Beyotime Biotech公司；显影定影试剂盒购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司；GAPDH抗体购自Proteintech Group公司；ALOX12抗体购自Invitrogen有限公司；HRP标记山羊抗兔二抗购自Proteintech Group公司；HRP标记山羊抗鼠二抗购自Proteintech Group公司。

1.1.2 实验细胞及实验动物

L-02细胞为三峡大学构建并惠赠予本实验室使用。清洁级雄性C57/BL6雄性小鼠36只，购自三峡大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SYXK（鄂）2022—0061；实验室动物中心动物伦理委员会批准号：2023070E。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞实验及动物实验分组及处理

L-02细胞分组：对照组、缺氧/复氧（H/R）组、H/R+吡非尼酮组，H/R组细胞恒温箱培养后缺氧8 h，复氧12 h，H/R+吡非尼酮细胞在恒温箱培养后予以吡非尼酮预（0.025 μmol/L）处理24 h，后予以缺氧8 h，复氧12 h。雄性C57/BL6小鼠36只分3组：假手术组、缺血/再灌注（I/R）组、I/R+吡非尼酮组，每组12只，I/R组与I/R+吡非尼酮组连续1周分别给予等量生理盐水与吡非尼酮（0.025 mL/g）预处理，然后用动脉夹夹闭肝动脉和肝静脉30 min，松开动脉夹，再灌注2 h。

1.2.2 L-02细胞H/R模型及小鼠肝脏I/R模型的建立

细胞造模：L-02细胞培养3 d后铺6孔板达到75%~80%左右，吡非尼酮处理12 h，按分组予以缺氧8 h，复氧12 h处理。动物造模：10%水合氯醛0.1 mL/10 g剂量麻醉小鼠，消毒，打开腹腔，分离门静脉（肝动脉、门静脉和胆管）用无创动脉夹夹闭30 min后松开，肝脏由紫黑色变为红色，再灌注成功，再灌注2 h后收集血液样本和肝脏样本。

1.2.3 Western blot法

用BCA法测蛋白质浓度后步骤：⑴ 上样；⑵ 电泳；⑶ 制胶；⑷ 转膜；⑸ 封闭；⑹ 孵一抗4 ℃过夜；⑺ 孵二抗室温孵育2 h；⑻ 显影。一抗抗体稀释比例：GAPDH 1∶5 000、ALOX12 1∶2 000；二抗抗体稀释比例：1∶4 000。

1.2.4 ELISA实验

TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度采用相应的试剂盒进行检测。

1.2.5 肝功能检测

取小鼠血液样本上清，使用生化分析仪检测丙氨酸氨基转氨酶（ALT）及天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量。

1.2.6 HE染色

取肝脏组织多聚甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片、烘烤固定、切片、染色，显微镜下观察肝细胞形态学改变。

1.3 统计学处理

所有实验结果均以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，两组间的数据比较采用独立样本t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析；采用GraphPad Prism 9软件绘制直方图，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 细胞实验

2.1.1 各组细胞炎症因子水平

与对照组比较，H/R组与H/R+吡非尼酮组TNF-α、IL1-β、IL-6水平均明显升高，但H/R+吡非尼酮组的上述炎症因子升高程度明显低于H/R组（均P<0.05）（图1）。

2.1.2 各组细胞ALOX12蛋白表达水平

与对照组比较，H/R组ALOX12蛋白表达有所上调，但差异无统计学意义（P>0.05）；H/R+吡非尼酮组ALOX12蛋白表达明显上调，与对照组及H/R组差异均有统计学意义（均P<0.05）（图2）。

2.2 动物实验

2.2.1 各组小鼠肝组织病理学检测

假手术组肝小叶基本完整，肝细胞排列紧密，分布均匀；与假手术组比较，I/R组与I/R+吡非尼酮组肝组织均有不同程度的损伤，但前者损伤严重，可见大量肝细胞坏死及水肿，后者损伤较轻，可见肝细胞部分坏死及水肿（图3）。

2.2.2 各组小鼠肝功能指标

与假手术组比较，I/R组与I/R+吡非尼酮组ALT、AST水平均明显升高，但I/R+吡非尼酮组ALT、AST的升高程度明显小于I/R组（均P<0.05）（图4）。

2.2.3 各组小鼠肝组织ALOX12蛋白表达水平

与假手术组比较，I/R组与I/R+吡非尼酮组肝组织ALOX12蛋白表达均明显上调，但I/R+吡非尼酮组ALOX12蛋白表达的上调程度明显低于I/R组（均P<0.05）（图5）。

3 讨　论

HIRI是临床上肝脏手术后常见的并发症之一。肝脏手术后虽然可以通过恰好的时机恢复血流补救肝脏的缺血，但是缺血肝脏再灌注依旧可以加剧组织损伤，甚至发展成无法挽救的严重坏死，目前临床中仍缺乏可以减弱HIRI的有用办法^[1]。本实验通过细胞实验和动物实验并在两个层面上观察了吡非尼酮药物对HIRI作用，结果显示，吡非尼酮能减轻HIRI的炎症反应和肝损伤程度。

HIRI的涉及多种机制，包括炎症因子、氧化应激/活性氧、细胞凋亡等^[11-14]。本研究首先在细胞实验中选择了TNF-α、IL-1β、IL-6作为炎症相关因子进行检测，结果显示，在H/R模型肝细胞中，TNF-α、IL-1β、IL-6的水平增高，而吡非尼酮预处理能抑制H/R肝细胞中上述炎症因子的释放。由于ALOX12信号通路在HIRI中起了关键作用，本研究继续观察了ALOX12蛋白在H/R肝细胞中的表达，结果显示，H/R肝细胞中ALOX12蛋白表达有所升高，而吡非尼酮预处理的肝细胞中ALOX12蛋白表达在H/R背景下仍低于对照组，说明吡非尼酮能有效抑制ALOX12的表达，且其抑制炎症反应的作用可能与该机制有关。

随后，本研究在动物模型中进一步验证吡非尼酮的抗HIRI作用，形态学与肝功能指标均显示，吡非尼酮预处理能有效减轻HIRI小鼠的肝组织损伤；进一步分析小鼠肝组织ALOX12蛋白的表达情况，结果显示，无论是I/R组还是I/R+吡非尼酮组肝组织ALOX12蛋白表达均较假手术组升高，这一点与细胞实验有所不同，但I/R+吡非尼酮组的升高程度明显减弱。笔者推测这种差异可能是因为细胞内的反应与在整体系统内反应的差异造成，但可以确定的是吡非尼酮能抑制ALOX12蛋白表达。

近些年，对于HIRI预防也有较多研究，先后研究了前列腺素E1、白藜芦醇、褪黑素、异丙酚、氨溴索、氟比洛芬酯、牛磺熊去氧胆酸、褪黑素在HIRI中的保护作用，而关于吡非尼酮在HIRI的研究中很少见^[15-22]。吡非尼酮是一种低毒性、可以治疗纤维化及损伤并极具有潜力的药物^[7]，近年来的基础研究和临床研究均发现吡非尼酮在多种器官的缺血再灌注损伤中发挥保护作用，比如吡非尼酮可以减轻大鼠小肠缺血再灌注损伤，减轻大鼠肺缺血再灌注损伤，预防大鼠急性肾损伤，改善睾丸扭转诱导的大鼠缺血再灌注损伤^[3-6,19]。关于吡非尼酮在HIRI的作用机制尚不明确，本研究结果将为其在HIRI作用机制深入探讨提供了切入点。

总之，本研究结果表明，吡非尼酮可通过抑制炎症反应发挥肝脏保护作用，其部分机制可能与其下调ALOX12的表达有关，进一步研究吡非尼酮抗HIRI的机制具有一定的科学价值和实际意义。

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基金资助

湖北省卫生厅科技计划基金资助项目(WJ2021M065)