长链非编码RNA NEAT1调控miR-124-3p/CTNNB1轴对胰腺癌细胞生物学功能的影响

Long noncoding RNA NEAT1 regulates the miR-124-3p/CTNNB1 axis to affect the biological functions of pancreatic cancer cells

摘要

背景与目的 长链非编码RNA（lncRNA）核富集转录体1（NEAT1）是一种致癌lncRNA，可通过竞争性内源性RNA（ceRNA）机制促进多种癌症进展。笔者前期通过TargetScan网站发现，NEAT1与微小RNA-124-3p（miR-124-3p），以及miR-124-3p与钙黏蛋白相关蛋白（CTNNB1）之间存在结合位点。因此，本研究探讨NEAT1、miR-124-3p、CTNNB1在胰腺癌中的表达，以及它们之间相互作用对胰腺癌细胞功能的影响。 方法 双荧光素酶报告基因试验验证NEAT1、miR-124-3p、CTNNB1的关系。检测胰腺癌组织及癌旁组织、胰腺癌PANC-1细胞及正常胰腺上皮H6C7细胞中NEAT1和miR-124-3p的表达水平，以及CTNNB1蛋白的表达情况。将NEAT1 siRNA转染或与miR-124-3p抑制物同时转染PANC-1细胞，评估转染后PANC-1细胞生物学功能、上皮-间充质转化相关蛋白表达以及在小鼠体内生长能力的变化。 结果 双荧光素酶报告基因试验证实NEAT1与miR-124-3p、miR-124-3p与CTNNB1之间存在靶向关系。胰腺癌组织（vs.癌旁组织）以及PANC-1细胞（vs. H6C7细胞）中，NEAT1与CTNNB1表达升高，miR-124-3p表达降低（均P<0.05）。转染NEAT1 siRNA后，PANC-1细胞NEAT1、CTNNB1表达降低，miR-124-3p表达增高，而同时转染miR-124-3p抑制物后，PANC-1细胞中miR-124-3p与CTNNB1上述表达变化被抑制（均P<0.05）。转染NEAT1 siRNA后，PANC-1细胞的增殖、迁移与侵袭能力明显减弱，凋亡率明显升高，E-cadherin蛋白表达上调，而N-cadherin、vimentin蛋白表达下调，在小鼠体内的生长能力明显降低（均P<0.05）；同时转染miR-124-3p抑制物PANC-1细胞上述指标的变化明显减弱（均P<0.05）。 结论 NEAT1可能通过ceRNA机制与miR-124-3p竞争性结合，削弱miR-124-3p对CTNNB1的抑制作用，从而上调CTNNB1表达，促进胰腺癌细胞的恶性生物学行为。

Abstract

Background and Aims Long noncoding RNA (lncRNA) nuclear-enriched abundant transcript 1 (NEAT1) is an oncogenic lncRNA that promotes the progression of various cancers through the competing endogenous RNA (ceRNA) mechanism. Using the TargetScan database, we previously identified binding sites between NEAT1 and microRNA-124-3p (miR-124-3p), as well as between miR-124-3p and catenin beta-1 (CTNNB1). Therefore, this study was conducted to investigate the expression of NEAT1, miR-124-3p, and CTNNB1 in pancreatic cancer and their interactions affecting pancreatic cancer cell functions. Methods A dual-luciferase reporter assay was used to validate the relationships among NEAT1, miR-124-3p, and CTNNB1. The expression levels of NEAT1 and miR-124-3p, as well as CTNNB1 protein expression, were detected in pancreatic cancer tissues and adjacent normal tissues, as well as in pancreatic cancer PANC-1 cells and normal pancreatic epithelial H6C7 cells. PANC-1 cells were transfected with NEAT1 siRNA alone or co-transfected with a miR-124-3p inhibitor. After transfection, changes in PANC-1 cell biological functions, epithelial-mesenchymal transition related protein expression, and tumor growth ability in mice were assessed. Results The dual-luciferase reporter assay confirmed the targeting relationships between NEAT1 and miR-124-3p, as well as between miR-124-3p and CTNNB1. NEAT1 and CTNNB1 expression levels were significantly upregulated, while miR-124-3p expression was downregulated in pancreatic cancer tissues (vs. adjacent tissues) and in PANC-1 cells (vs. H6C7 cells) (all P<0.05). NEAT1 siRNA transfection led to decreased NEAT1 and CTNNB1 expression and increased miR-124-3p expression in PANC-1 cells. However, co-transfection with a miR-124-3p inhibitor suppressed the expression changes in miR-124-3p and CTNNB1 (all P<0.05). NEAT1 siRNA transfection significantly reduced PANC-1 cell proliferation, migration, and invasion, while promoting apoptosis. Additionally, E-cadherin protein expression was upregulated, whereas N-cadherin and vimentin protein expression were downregulated. Tumor growth in mice was also significantly inhibited (all P<0.05). These changes were attenuated upon co-transfection with the miR-124-3p inhibitor (all P<0.05). Conclusion NEAT1 may act as a ceRNA by competitively binding to miR-124-3p, thereby attenuating miR-124-3p-mediated inhibition of CTNNB1. This leads to CTNNB1 upregulation, ultimately promoting the malignant biological behavior of pancreatic cancer cells.

Graphical abstract

关键词

胰腺肿瘤 / RNA，长链非编码 / 微RNAs / 细胞增殖 / 肿瘤侵润

Key words

Pancreatic Neoplasms / RNA, Long Noncoding / MicroRNAs / Cell Proliferation / Neoplasm Invasiveness

胰腺癌是世界上最致命的癌症之一，5年生存率不到10%^[1]。据报道^[2-3]，近年来中国胰腺癌发病率逐渐增加，且在未来20年将持续增高。众所周知，由于目前尚无针对胰腺癌的特异性筛查方法，且大多数处于胰腺癌早期的患者无症状^[4]，因此，患者直到疾病达到中期或晚期才被诊断出来。与其他类型的肿瘤相比，胰腺癌的治疗进展很少。尽管在过去的10年中，免疫疗法和靶向治疗在许多实体瘤中取得了成功，但这些药物并没有显示出对胰腺癌患者有显著的益处，化疗仍然是主要的治疗方案^[5]。胰腺癌的分子异质性可能需要基于个体肿瘤特征的多种治疗方法^[6]。因此，了解胰腺癌所涉及的潜在分子机制对于制定更有效的治疗策略至关重要。已有大量研究^[7-8]发现长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）可以对胰腺癌的治疗起到积极效果。lncRNA核富集转录体1（NEAT1）作为一种致癌lncRNA，通过竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制在结肠癌^[9]、黑色素瘤^[10]、乳腺癌^[11]中促进肿瘤形成、转移的作用。近期发现，胰腺癌组织中NEAT1上调表达，其高表达与TNM分期、远处转移和肿瘤大小有关，也预示着预后不良，NEAT1可以促进胰腺癌生长和转移^[12]。笔者通过TargetScan网站（https://starbase.sysu.edu.cn）发现NEAT1与微小RNA-124-3p（miR-124-3p），以及miR-124-3p与钙黏蛋白相关蛋白（CTNNB1）自检存在结合位点。此外，研究证据显示，在食管鳞状细胞癌中，NEAT1可靶向下调miR-124-3p表达^[13]；miR-124-3p上调可以抑制胰腺癌细胞的增殖^[14]；CTNNB1上调促进胰腺癌生长并预测预后不良^[15]。因此，笔者推测NEAT1可能结合miR-124-3p调控靶基因CTNNB1的表达，从而影响肿瘤细胞的生物学行为。本研究探讨NEAT1、miR-124-3p、CTNNB1在胰腺癌中的表达，以及它们之间相互作用对胰腺癌细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

人胰腺癌细胞PANC-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司；人胰腺上皮细胞系HPDE6-C7（H6C7）购自上海传秋生物科技有限公司；NEAT1 siRNA（si-NEAT1）、阴性对照siRNA（si-NC）、miR-124-3p抑制物（miR-124-3p inhibitor）、抑制物阴性对照（inhibitor NC）、miR-124-3p模拟物（miR-124-3p mimic）、TRIzol试剂（货号：B511311-0100）均购自上海生工；CCK-8试剂盒（货号：CA1210），北京索莱宝科技有限公司；NEAT1野生型质粒（NEAT1-WT）、NEAT1突变型质粒（NEAT1-MUT）、CTNNB1野生型质粒（CTNNB1-WT）和突变型质粒（CTNNB1-MUT）由上海生工构建；上皮钙黏附素（E-cadherin，货号：ab231303）、神经型钙黏附蛋白（N-cadherin，货号：ab76011）、波形蛋白（vimentin，货号：ab20346）、CTNNB1抗体（货号：ab16051）购自Abcam；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（货号：FY-PLS5835），上海富雨生物科技有限公司；增强化学发光系统试剂盒（货号：SQ101），上海雅酶生物医药科技有限公司。

1.2 临床样本

收集2018—2022年在湖北省武汉市第三医院就诊患胰腺癌的15例患者的胰腺癌组织（胰腺癌组）及其邻近癌旁组织（正常组），本研究所有患者均签订知情同意书，且该实验获得武汉市第三医院伦理委员会的批准（批号：202301006）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组

将人胰腺癌细胞系PANC-1以及人胰腺上皮细胞系H6C7培养在DMEM培养基，培养基含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素，培养环境为37 ℃，5% CO₂。将PANC-1细胞按照3×10⁵个/孔的密度接种在6孔培养板上，分别转染si-NC、si-NEAT1）、si-NEAT1+inhibitor NC、si-NEAT1+miR-124-3p inhibitor，用转染试剂盒转染48 h。以不经任何处理的PANC-1细胞为空白对照。

1.3.2 双荧光素酶报告基因实验

通过TargetScan网站（https://starbase.sysu.edu.cn）发现NEAT1与miR-124-3p，miR-124-3p与CTNNB1存在结合位点。将覆盖野生型和突变型miR-124-3p结合位点的NEAT1或CTNNB13'非翻译区片段克隆到pmirGLO双荧光素酶载体中。然后将这些载体与指定的质粒共转染到PANC-1细胞中48 h，测定萤火虫和Renilla荧光素酶的活性。根据制造商的方案，使用微孔板读取器检测相应的吸光度。然后，将相对荧光素酶活性归一化为萤火虫荧光素酶内控。

1.3.3 qRT-PCR检测NEAT1、miR-124-3p表达

组织和细胞的总RNA提取使用TRIzol试剂。将提取的RNA逆转录为互补DNA，并按照试剂盒说明书进行PCR，首先将特异性PCR引物、Mix、ddH₂O配置成20 μL体系，随后，在实时PCR系统上进行qRT-PCR。PCR条件如下：95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40个循环。使用GAPDH作为NEAT1的内源性对照，U6作为miR-124-3p的内源性对照，分析NEAT1和miR-124-3p表达。最后，采用2^-ΔΔCt法进行计算。用于qRT-PCR的引物序列见表1。

1.3.4 Western blot测量CTNNB1、N-cadherin、E-cadherin、vimentin蛋白表达

首先，RIPA裂解缓冲液用来提取PANC-1细胞、H6C7细胞以及胰腺癌组织、癌旁组织的总蛋白。通过BCA试剂盒确定蛋白浓度后，在10% SDS-PAGE上电泳，然后转移到PVDF膜。接下来，在5%脱脂牛奶中阻断膜，然后用靶向E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）、vimentin（1∶2 000）、CTNNB1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）的一抗在4 ℃孵育。次日，在室温下用二抗孵育2 h。增强化学发光系统试剂盒用于检测信号，Image J用于定量分析。

1.3.5 CCK-8法分析PANC-1细胞增殖

收集各组PANC-1细胞，并将其接种于96孔板（1×10⁴个/孔）中，37 ℃和5% CO₂培养48 h。然后，添加CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。测量450 nm处吸光度。

1.3.6 流式细胞术分析PANC-1细胞凋亡

将细胞浓度调节至7×10⁴个/mL。然后用500 μL结合缓冲液重悬细胞，添加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI在4 ℃下避光15 min。最后，使用流式细胞仪评估PANC-1细胞凋亡率。

1.3.7 Transwell试验测定PANC-1细胞迁移和侵袭

将转染的PANC-1细胞悬浮在无FBS培养基中并接种到孔径为8 μm的Transwell腔室的上室。将含有10% FBS（600 μL）的DMEM培养基添加到下室中。培养24 h后，用棉签去除上室中未穿膜的细胞，同时将上室底面的细胞固定乙醇中，然后用0.1%结晶紫染色30 min。最后，在光学显微镜下计数。Transwell腔室的上室预涂Matrigel基质胶，按照上述方法操作，以测量细胞侵袭。

1.3.8 异种移植肿瘤模型

从湖北贝恩特生物科技有限公司[许可证号：SCXK（鄂）2021－0027]购买6周龄雄性BALB/c裸鼠。将上述分组的细胞以1×10⁵个/mL分别注射到BALB/c裸鼠的右侧腋窝皮下，在注射后第35天处死所有裸鼠，取出裸鼠肿瘤并称重。根据公式（体积=肿瘤长度×肿瘤宽度²/2）计算肿瘤体积。本研究试验已获得武汉市第三医院动物伦理委员会的批准（批号：202201009）。

1.4 统计学处理

所有数据均在SPSS 25.0软件处理，经正态分布、方差齐性检验后的数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。t检验用于比较NEAT1、miR-124-3p、CTNNB1在胰腺癌组织、癌旁组织及PANC-1细胞、H6C7细胞中的表达差异，多组间比较用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 胰腺癌细胞中miR-124-3p、NEAT1、CTNNB1的关系

双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-124-3p mimic降低了WT-NEAT1和WT-CTNNB1组的荧光素酶活性（均P<0.05），而MUT-NEAT1和MUT-CTNNB1的荧光素酶活性几乎不变（均P>0.05）（图1）。

2.2 NEAT1、miR-124-3p、CTNNB1在胰腺癌组织及细胞中的表达

与癌旁正常组织比较，胰腺癌组织中NEAT1、CTNNB1表达水平增高，miR-124-3p表达降低（均P<0.05）；与H6C7细胞比较，PANC-1细胞中NEAT1、CTNNB1表达水平升高，miR-124-3p表达降低（均P<0.05）（图2-3）。

2.3 转染后各组细胞NEAT1、miR-124-3p、CTNNB1表达的变化

与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组NEAT1、CTNNB1水平降低，miR-124-3p表达增高（均P<0.05）；与si-NEAT1组、si-NEAT1+inhibitor NC组比较，si-NEAT1+miR-124-3p inhibitor组CTNNB1水平升高，miR-124-3p表达下降（均P<0.05）（图4）。

2.4 转染后各组PANC-1细胞增殖能力的变化

与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组OD₄₅₀值降低（均P<0.05）；与si-NEAT1组、si-NEAT1+inhibitor NC组比较，si-NEAT1+miR-124-3p inhibitor组OD₄₅₀值增高（均P<0.05）（表2）。

2.5 转染后各组PANC-1细胞凋亡率的变化

与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组凋亡率升高（均P<0.05）；与si-NEAT1组、si-NEAT1+inhibitor NC组比较，si-NEAT1+miR-124-3p inhibitor组凋亡率降低（均P<0.05）（图5）（表3）。

2.6 转染后各组PANC-1细胞侵袭、迁移能力的变化

与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组迁移、侵袭细胞数量降低（均P<0.05）；与si-NEAT1组、si-NEAT1+inhibitor NC组比较，si-NEAT1+miR-124-3p inhibitor组迁移、侵袭细胞数量增高（均P<0.05）（图6）。

2.7 转染后各组PANC-1细胞上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白表达的变化

与空白对照组、si-NC组比较，si-NEAT1组细胞E-cadherin蛋白表达增高，N-cadherin、vimentin蛋白表达降低（均P<0.05）；与si-NEAT1组、si-NEAT1+inhibitor NC组比较，si-NEAT1+miR-124-3p inhibitor组细胞E-cadherin蛋白表达下降，N-cadherin、vimentin蛋白表达增高（均P<0.05）（图7）。

2.8 转染后各组PANC-1细胞在小鼠体内生长情况

si-NEAT1组肿瘤体积、肿瘤质量明显小于空白对照组、si-NC组比较（均P<0.05）；si-NEAT1+miR-124-3p inhibitor组肿瘤体积、肿瘤质量明显大于si-NEAT1组、si-NEAT1+inhibitor NC组（均P<0.05）（图8）（表4）。

3 讨　论

胰腺癌是最普遍的恶性肿瘤之一，是全球主要的公共卫生问题^[16]，其5年生存率约为8%，主要原因是诊断较晚且缺乏有效治疗^[17]。因此，迫切需要更好地了解胰腺癌进展中涉及的分子机制，确定治疗胰腺癌的新靶点和开发新的治疗策略。

研究^[18-20]表明，lncRNA生物标志物和lncRNA靶向治疗越来越受到人们的关注，大量研究证实lncRNA在包括胰腺癌在内的各种人类恶性肿瘤中发挥着重要作用。据报道^[21]，NEAT1是消化系统肿瘤中的不良预后因素。已有研究^[22]发现，NEAT1可能抑制胰腺癌的发生和发展。NEAT1在体外可能促进胰腺癌细胞增殖、迁移和吉西他滨耐药性，并增强体内致瘤性^[23]。在本研究中，在胰腺癌组织以及PANC-1细胞中，NEAT1、CTNNB1高表达，miR-124-3p低表达，故本研究通过转染si-NEAT1来沉默NEAT1进而探讨NEAT1在胰腺癌细胞中的作用。结果显示，沉默NEAT1使PANC-1细胞OD₄₅₀值、裸鼠肿瘤体积、肿瘤质量下降，凋亡率升高，表明沉默NEAT1可能在体外抑制胰腺癌细胞的恶性生物学行为，在体内抑制移植瘤的生长。EMT过程涉及胚胎发育过程中的形态发生，并且还促进肿瘤发生中的恶性进展^[24]。在EMT过程中，上皮细胞通过下调E-cadherin失去其上皮特征，通过上调N-cadherin和vimentin获得间质表型^[25]。PANC-1细胞在EMT过程后获得迁移和侵入周围基质的能力，随后通过血液和淋巴管途径进一步扩散，进而发展为晚期胰腺癌^[26]。因此，抑制胰腺癌细胞EMT过程的发生可以抑制胰腺癌进展。本实验结果显示，沉默NEAT1降低了PANC-1细胞的迁移、侵袭数量，下调了N-cadherin、vimentin蛋白表达，上调了E-cadherin蛋白表达，表明沉默NEAT1可抑制PANC-1细胞获得间质表型，抑制PANC-1细胞发生迁移和侵袭，进而抑制胰腺癌的进展。据报道^[27-28]，EMT由相关转录因子（Snail、Zeb、Slug、Twist）介导，转录因子的激活可促进EMT激活。本研究推测NEAT1可能通过调节Snail等转录因子的水平促进EMT进程，进而促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。但这需要在未来的实验研究中证实。

生物信息学预测结果显示，miR-124-3p是NEAT1的可能靶基因。以上研究已经证实NEAT1在胰腺癌的作用，Guo等^[29]发现，沉默miR-124-3p促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和化学耐药性。Idichi等^[30]研究显示，miR-124-3p在胰腺导管腺癌中表达下调。与上述研究一致，本实验结果显示，miR-124-3p在胰腺癌组织和PANC-1细胞中低表达，抑制miR-124-3p减轻了NEAT1沉默对PANC-1细胞迁移、侵袭、增殖的抑制作用。提示NEAT1可能通过miR-124-3p影响PANC-1细胞进展。接着，本研究探索了miR-124-3p的靶mRNA，发现在PANC-1细胞中miR-124-3p直接靶向CTNNB1。据报道，胰腺癌中CTNNB1上调表达，抑制其表达可阻碍胰腺癌细胞的转移、增殖能力，并抑制胰腺癌细胞干性^[31]。本实验结果显示，PANC-1细胞中CTNNB1高表达，与上述研究一致，说明CTNNB1在胰腺癌进展中起促进作用。在PANC-1细胞中沉默NEAT1后，CTNNB1蛋白表达下降；提高miR-124-3p表达后，CTNNB1蛋白表达增高，提示沉默NEAT1对PANC-1细胞迁移、侵袭、EMT和增殖的抑制作用及对凋亡的促进作用可能是通过提高miR-124-3p表达、降低CTNNB1表达来实现的。

综上所述，NEAT1可能通过ceRNA机制与miR-124-3p竞争性结合，削弱miR-124-3p对CTNNB1的抑制作用，从而上调CTNNB1表达，促进胰腺癌细胞的恶性生物学行为。但本研究尚有不足之处，首先是仅使用一种胰腺癌细胞系进行功能验证实验；其次是未进行miR-124-3p调控CTNNB1表达的回复实验；最后是只关注了裸鼠移植瘤的生长，未在体内进行机制研究。以上不足也将是后续研究的重点。

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基金资助

湖北省卫生健康委员会科研基金资助项目(WJ2023M129)