m6A阅读器IGF2BP2在胰腺癌中的表达及意义

Expression and significance of m6A reader IGF2BP2 in pancreatic cancer

摘要

背景与目的 N⁶-甲基腺苷（m6A）表观遗传学修饰对基因转录后的表达及生理、病理过程，包括肿瘤发生都有重要的调控作用。m6A阅读器IGF2BP2能够显著增强mRNA的稳定性和翻译效率，并在多种肿瘤中存在表达异常。然而，目前IGF2BP2在胰腺癌中的具体生物学功能尚不明确。因此，本研究探讨m6A阅读器IGF2BP2在胰腺癌中的表达及对胰腺癌细胞功能的影响。 方法 采用癌症基因组图谱（TCGA）、基因型及基因表达量关联数据库（GTEX）和基因表达综合数据库（GEO）分析m6A编辑器、擦除器和阅读器相关基因的表达水平，并采用Kaplan-Meier生存曲线分析m6A阅读器IGF2BP2表达与胰腺癌患者预后的关系；采用免疫组化在胰腺癌组织及癌旁组织临床标本中验证IGF2BP2的表达水平；采用CCK-8实验、流式细胞周期检测、平板克隆形成实验、Transwell分析m6A阅读器IGF2BP2敲低后胰腺癌细胞增殖活性、细胞周期、克隆形成数目与迁移能力的变化。 结果 TCGA-GTEX及GEO数据库分析显示，m6A阅读器基因IGF2BP2在胰腺癌组织中高表达（均P<0.05），且高表达与不良的总体生存期相关（均P<0.05）。临床标本的免疫组化结果证实m6A阅读器IGF2BP2在胰腺癌组织的表达高于癌旁组织。功能性实验结果显示，IGF2BP2基因敲减后，两株细胞的增殖能力明显减弱，且细胞周期更多停在静止期（G0~G1期），细胞克隆形成数目明显减少，细胞迁移能力明显降低（均P<0.05）。 结论 m6A阅读器IGF2BP2在胰腺癌组织中呈高表达，且与胰腺癌患者不良预后密切相关，其作用机制可能与促进癌细胞生长与迁移有关。

Abstract

Background and Aims N⁶-methyladenosine (m6A) epigenetic modification plays a crucial role in post-transcriptional gene expression regulation and various physiological and pathological processes, including tumorigenesis. The m6A reader IGF2BP2 significantly enhances mRNA stability and translation efficiency and is abnormally expressed in multiple cancers. However, the specific biological function of IGF2BP2 in pancreatic cancer remains unclear. Therefore, this study investigated the expression of the m6A reader IGF2BP2 in pancreatic cancer and its effects on pancreatic cancer cell functions. Methods The expression levels of m6A-related writers, erasers, and readers were analyzed using The Cancer Genome Atlas (TCGA), the Genotype-Tissue Expression (GTEX) database, and the Gene Expression Omnibus (GEO). Kaplan-Meier survival analysis was conducted to assess the relationship between IGF2BP2 expression and the prognosis of pancreatic cancer patients. Immunohistochemistry was used to validate IGF2BP2 expression in clinical specimens of pancreatic cancer tissues and adjacent normal tissues. Functional experiments, including CCK-8 assay, flow cytometry for cell cycle analysis, colony formation assay, and Transwell migration assay, were performed to evaluate changes in cell proliferation, cell cycle distribution, colony formation ability, and migration capacity after IGF2BP2 knockdown in pancreatic cancer cells. Results TCGA-GTEX and GEO database analyses showed that IGF2BP2 was highly expressed in pancreatic cancer tissues (both P<0.05) and that its high expression was associated with poor overall survival (both P<0.05). Immunohistochemical staining of clinical specimens confirmed that IGF2BP2 protein expression was higher in pancreatic cancer than in adjacent normal tissue. Functional experiments demonstrated that IGF2BP2 knockdown significantly reduced the proliferation ability of pancreatic cancer cells, arrested more cells in the G0-G1 phase, decreased colony formation, and impaired cell migration (all P<0.05). Conclusion The m6A reader IGF2BP2 is highly expressed in pancreatic cancer tissues and is closely associated with poor prognosis in patients with this disease. Its mechanism of action may be related to the promotion of cancer cell growth and migration.

Graphical abstract

关键词

胰腺肿瘤 / 甲基化 / IGF2BP2 / 预后 / 生物标记，肿瘤

Key words

Pancreatic Neoplasms / Methylation / IGF2BP2 / Prognosis / Biomarkers, Tumor

胰腺癌是一种发病率持续上升且致命性高的消化系统肿瘤，2024年美国癌症统计数据^[1]表明，胰腺癌在美国男性中发病率排第10位（占3%），在女性中排第7位（占3%），同时，男性病死率排第4位（占8%），女性病死率排第3位（占8%），且5年生存率仅约为13%，处于所有恶性肿瘤中最低水平。因此，积极研究胰腺癌的成因和寻找新的有效治疗方法对于其临床治疗具有重大意义。

N⁶-甲基腺漂岭（N⁶-methyladenosine，m6A）是指腺嘌呤（A）第6位氮原子（N）上发生甲基化修饰，是真核生物信使RNA（mRNA）最为普遍的表观遗传学修饰方式。m6A甲基化通过影响mRNA的可变剪接、定位、稳定性以及翻译效率等方式调控相关基因表达和功能表型，进而参与肿瘤增殖、迁移等多种病理生理过程^[2-4]。m6A修饰过程主要由编辑器-甲基化转移酶、擦除器-去甲基化酶和阅读器介导^[5]，mRNA上的m6A标记主要由甲基转移酶复合物（METTL3/METTL14/WTAP）及辅助因子^[6]共同修饰完成，并且可以被去甲基化酶（如FTO或ALKBH5）^[7]去除。m6A表观遗传学修饰的效应主要依赖于m6A阅读器，首个被发现的m6A阅读器是YTHDF2，其通过调控mRNA的稳定性，影响急性髓细胞性白血病的发生和进展^[8]，m6A编辑器及擦除器相关基因及蛋白已被多项研究证明在各种类型的恶性肿瘤中发挥关键的致癌作用^[9]。

胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP）家族是一类新发现的m6A阅读器蛋白，可以稳定含有m6A修饰的mRNA，并且通过K同源（KH）结构域促进翻译^[10-12]，参与表达调控。目前研究均聚焦探索IGF2BP家族在恶性肿瘤中的致癌作用，如结直肠癌、白血病、胰腺癌等^[13-16]。然而，IGF2BP2作为被新发现的m6A阅读器对恶性肿瘤中的生物学功能的研究有限，因此，本研究探索m6A阅读器在胰腺癌中的表现，及其对胰腺癌细胞增殖、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 数据的收集

使用GP6244平台，从癌症基因组图谱（TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov）中收集胰腺组织样本的转录组数据，其中胰腺癌样本178例，癌旁组织样本4例。从基因型及基因表达量关联数据库（GTEX，https://xenabrowser.net/datapages）中收集胰腺组织样本的转录组数据，正常胰腺组织样本167例。从基因表达综合数据库（GEO，https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo）下载胰腺癌相关基因表达数据集GSE28735、GSE62452中的表达数据。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

将常规保存于中南大学湘雅三医院中心实验室的BXPC3和SW1990人胰腺癌细胞株接种于含有10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO₂的孵育箱中培养，每隔2~3 d传代1次。

1.2.2 免疫组化

将癌和癌旁组织切片置于玻片上，放入60 ℃恒温箱中烘烤60 min，使其固定，玻片浸泡于二甲苯中脱蜡3次，10 min/次。依次将玻片浸入100%、95%、85%、70%、50%的乙醇溶液中，每个步骤3 min，蒸馏水冲洗，完成水化；滴加3%过氧化氢溶液于组织切片上，室温孵育10 min，去除内源性过氧化物酶活性；采用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤3次，每次5 min，玻片置于柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复，微波炉100 ℃，10 min；切片自然冷却至室温，采用PBS冲洗切片3次，每次5 min；采用5%牛血清白蛋白（BSA）在室温下孵育切片30 min，阻断非特异性蛋白结合位点。倾去封闭液，不洗涤，滴加兔多克隆IGF2BP2抗体（1∶300稀释），确保完全覆盖组织，4 ℃孵育过夜，确保抗体与抗原充分结合，使用PBS缓冲液轻轻洗涤切片3次，每次5 min。滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶50稀释），确保覆盖整个组织，室温孵育1 h，使用PBS洗涤切片3次，每次5 min，向切片滴加DAB显色剂，于显微镜下观察，直至切片出现棕色或棕黄色，用蒸馏水轻轻冲洗10 min终止反应；将切片置于苏木精染液中染色1 min，自来水冲洗切片，浸泡10 min，使组织返蓝，按脱蜡的逆向顺序将切片依次置于70%、85%、95%和100%乙醇中脱水，每个步骤3 min；将切片置于二甲苯中透明，共2次，每次5 min；滴加中性树胶于切片上，盖上盖玻片，常温下晾干切片；于显微镜下观察癌和癌旁组织中IGF2BP2的表达情况（阳性信号表现为棕色或棕黄色颗粒），并评估癌和癌旁组织中IGF2BP2表达水平。

1.2.3 细胞转染

Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；阴性对照小干扰RNA（si-NC），IGF2BP2小干扰RNA（si-IGF2BP2）购自吉玛基因；提取RNA试剂盒、cDNA逆转录试剂盒和RT-PCR试剂盒源于翌圣生物（中国上海，11123ES）。按照常规方法将BXPC3、SW1990细胞分别于中板培养，当细胞融合度为60%时，使用无血清的培养液洗涤细胞，并按照Lipofectamine 3000步骤依次转染si-NC（si-NC组）和si-IGF2BP2（si-IGF2BP2组），再孵育48 h后备用。

1.2.4 qRT-PCR

使用TRIzol试剂提取转染后si-NC组和si-IGF2BP2组细胞的总RNA，检测RNA浓度及纯度；逆转录获得cDNA，-20 ℃保存备用；采用SYBR Green试剂盒，在荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR分析，PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环，72 ℃，延伸5 min；实验重复3次。采用2^-ΔΔCt法计算IGF2BP2的相对表达量，即ΔCt=Ct_样本-Ct_内参，以GAPDH作为内参基因。

1.2.5 Western blot

将BXPC3及SW1990细胞分别接种至6孔板，接种量为2×10⁴/孔，5% CO₂、37 ℃培养箱孵育，待细胞密度达到50%~60%/孔，实验设置转染si-NC组、si-IGF2BP2组（转染体系5 μL lipo3000，10 μL si-NC或si-IGF2BP2分别加入500 μL无血清基础培基，混匀静置15 min，再分别加入已更换1 500 μL新鲜培基的6孔板中），5% CO₂、37 ℃培养箱转染48 h。每孔加入200 μL细胞裂解液（1 mL Lysis buffer中加入磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂各10 μL），冰上裂解20~30 min，再分别移至2 mL微量离心管中，14 000 rmp，4 ℃离心15 min，取上清即为细胞全蛋白提取物，BCA法测定蛋白浓度，计算上样量。按4∶1加入上样缓冲液，95 ℃煮沸10 min，完成蛋白提取。制备10% SDS-PAGE凝胶，待凝固加入电泳缓冲液，拔出梳子，加入蛋白分子量标记物（mark），以及根据BCA法测定的IGF2BP2蛋白在si-NC组和si-IGF2BP2组中的浓度，按每孔上样量为10 μg计算并加入相应体积蛋白样品，恒压80 V，20 min，转120 V，30 min；转膜，PVDF膜甲醇活化1 min后，黑-胶-膜顺序，加入转膜缓冲液，冰浴，恒流400 mA，30 min，转膜后裁膜，按照mark位置分别裁出IGF2BP2及β-actin分子量段条带，快速封闭液封闭10~15 min，将膜分别置于IGF2BP2一抗、β-actin一抗溶液中，4 ℃孵育过夜；TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次10 min，以移除未结合的一抗；将膜转移到二抗溶液，室温下摇床孵育1 h，TBST溶液将PVDF膜清洗3次，每次10 min；配制ECL显影液，各张膜依次显影。

1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖

将BXPC3及SW1990细胞转染48 h后的si-NC组、si-IGF2BP2组，分别胰酶消化并接种至96孔板（5×10³/孔）并孵育24 h贴壁；培养皿稍倾斜，移液枪贴底部洗净培养基；按浓度梯度每组不少于3个复孔；观察细胞生长到一定的密度弃去培养基，使用PBS洗涤细胞1次；每孔加入100 μL含有10% CCK-8的新鲜完全细胞培养基。37 ℃孵育30~60 min，采用酶标仪于450 nm处的吸光度测量活细胞数量。

1.2.7 流式细胞周期检测

将BXPC3和SW1990细胞分别以每孔1×10⁴细胞的密度接种于6孔板中，37 ℃孵育过夜，PBS清洗3遍，分别转染si-NC、si-IGF2BP2，37 ℃孵育48 h。将培养细胞分别收集至离心管，1 000 r/min离心5 min，吸除上清，留底部沉淀细胞约50 μL；向每个离心管中加入1 mL预冷的PBS，轻轻重悬细胞，并转移到新的离心管中，1 000 rpm离心5 min，吸除上清；向每个样品中加入1 mL预冷的70%乙醇，轻轻吹打使细胞均匀分散，在4 ℃下固定2 h，1 000 r/min离心5 min，吸除上清；加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，离心（1 000 rpm，5 min），弃去上清；每个样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，缓慢而充分地重悬细胞以确保均匀染色；37 ℃、避光条件下孵育30 min，使细胞充分染色，样品送至流式细胞仪进行检测。

1.2.8 平板克隆形成实验

使用0.25%的胰蛋白酶处理对数生长期的BXPC3和SW1990细胞转染样本，轻轻震荡制成单细胞悬浮液后，接种于6孔板上（1 000个细胞/孔），置37 ℃、5% CO₂温箱培养，待克隆肉眼可见时终止培养，并丢弃培养基，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色30 min，最后计数克隆数。

1.2.9 细胞迁移实验

将分别已转染48 h的si-NC、si-IGF2BP2的SW1990、BXPC3细胞消化，并分别将细胞密度调整为×10⁴/mL备用；取1块24孔板，向每孔加入600 μL含有20%胎牛血清的完全培养基（作为趋化因子吸引细胞迁移），将Transwell小室插入24孔板的孔中，si-NC组、si-IGF2BP2组各设置3个复孔，在Transwell小室的上室中加入100 μL无血清培养基，确保覆盖底部的膜。在Transwell的上室中每个孔分别加入si-NC组或si-IGF2BP2组100 μL已调整好密度的细胞悬液（细胞数量约为2×10³细胞/孔），轻轻摇晃24孔板，确保细胞均匀分布在Transwell膜上；将24孔板置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h；培养结束后，取出Transwell小室，使用PBS轻轻冲洗上室，去除未迁移的细胞，棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，Transwell小室在4%多聚甲醛中固定10~15 min，PBS清洗小室2次，向下室加入结晶紫并孵育10~30 min，使用PBS清洗以去除过量染料，采用倒置显微镜观察膜底部的迁移细胞，高倍镜随机选取3个视野，计算细胞数。

1.3 统计学处理

应用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，两样本的比较采用t检验，每项实验至少重复进行3次。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 m6A相关基因的差异表达

分别将TCGA与GTEX数据库及GEO数据集GSE28735与GSE62452胰腺癌数据合并矩阵并去批次效应，m6A编辑器相关基因（ZC3H13、RBM15B、METTL3、RBM15、METTL14、WTAP）、擦除器相关基因（FTO、ALKBH5）、阅读器相关基因（HNRNPA2B1、YTHDF1、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF3、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、RBMX、YTHDF2、HNRNPC）中有18个相关基因在TCGA-GTEX数据库（胰腺癌样本178例、正常胰腺样本171例）显示具有明显的表达差异，其中IGF2BP2在胰腺癌中呈高表达（均P<0.05）；19个m6A表观遗传学修饰相关基因中有17个在GEO数据集胰腺癌样本（n=114）和正常胰腺样本（n=106）中表达，并有9个显示差异化表达，其中IGF2BP2在胰腺癌中呈高表达（均P<0.05）（图1-2）。

2.2 IGF2BP2高表达与胰腺癌预后的关系

TCGA-GTEX、GEO数据库中Kaplan-Meier生存分析显示，m6A阅读器IGF2BP2高表达与较差的总体生存期相关（均P<0.05）（图3）。

2.3 IGF2BP2在肿瘤样本中的表达情况

进一步用临床样本通过免疫组化验证其表达情况，结果与生信分析相一致的是，相较于胰腺正常组织，IGF2BP2在肿瘤样本中呈明显高表达（图4）。

2.4 IGF2BP2对胰腺癌细胞生物学功能的影响

为了进一步分析m6A阅读器IGF2BP2的生物学功能，选择了两种胰腺癌细胞株（SW1990及BXPC3）作为研究对象。转染效果分析显示，两株细胞进行IGF2BP2基因敲减后，si-IGF2BP2组的IGF2BP2表达在转录水平及蛋白水平均较各自si-NC组明显降低（均P<0.05）（图5）。IGF2BP2基因敲减后，两株细胞的增殖能力明显减弱，且细胞周期更多停在静止期（G0~G1期），细胞克隆形成数目明显减少，细胞迁移能力明显降低（均P<0.05）（图6）。

3 讨　论

越来越多的研究证据揭示，m6A是真核生物mRNA中最常见的转录后修饰，对于mRNA的稳定性具有重要的意义^[17]，m6A修饰与多种癌症存在显著关联，例如白血病、结直肠癌、乳腺癌、肝癌等^[13,18-20]。因此，m6A修饰引起表型遗传学改变的深层机制值得进一步探索。在胰腺癌中，研究发现多个m6A相关基因在胰腺癌患者中异常表达，这些基因包括METTL3、METTL14等核心m6A甲基转移酶，以及m6A修饰的关键阅读器蛋白，如IGF2BP2、YTHDF1和YTHDF2等^[21-22]。通过对TCGA和GEO数据库的整合分析，发现胰腺癌中存在9个m6A相关基因的显著表达差异，尤其是m6A阅读器IGF2BP2在胰腺癌组织中相较癌旁显著高表达，提示其可能在胰腺癌的进展中发挥关键作用。

m6A阅读器包括IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3等，人类胰岛素样生长因子2（IGF2）mRNA结合蛋白家族（IMP/IGF2BP）参与了一系列的生物过程，包括发育、肿瘤生成和干细胞性质^[23]，IGF2BP2隶属此家族且其被鉴定为IGF2 mRNA结合蛋白，具有协助IGF2家族mRNA转运到胞质，可增强mRNA稳定性和协助翻译的功能^[24]。在IGF2BP1缺失的裸鼠模型中，其体内的卵巢癌细胞生长和转移能力明显减弱^[25]。其次，敲除胰腺癌PANC-1细胞中的IGF2BP1发现，大部分细胞阻滞在G1期，从而抑制肿瘤的生长^[23]。在肝癌中，IGF2BP3的高表达与较差的预后密切相关，并且与肿瘤转移的程度有着高度的关联^[26]。基于对IGF2BP家族的前期研究，本研究旨在探讨IGF2BP2对胰腺癌表型的影响。本研究首先整合了TCGA-GTEX及GSE28735-GSE62452数据集，去除了批次效应，解决了正常样本量较少导致的分析可靠性问题。通过生信发现IGF2BP2相较于IGF2BP1及IGF2BP3在胰腺癌组织中相对表达更高，较癌旁组织高表达更显著，并且与患者不良预后密切相关，提示其在胰腺癌发生或者发展中发挥重要作用。

近年来，m6A阅读器IGF2BP2在多种肿瘤的发生和发展机制中受到了广泛关注，其在不同类型肿瘤中的作用机制已进行了研究。在结直肠癌中，IGF2BP2通过识别并结合m6A修饰的SOX2 mRNA，增强了SOX2 mRNA的稳定性，维持SOX2的高表达水平，从而推动了癌细胞的干性维持、侵袭和转移能力增强^[14,27]。在急性白血病中，m6A阅读器IGF2BP2通过稳定关键基因（如MYC、GPT2和SLC1A5）的mRNA并促进翻译，增强谷氨酰胺代谢，维持癌细胞的能量供应，促进癌细胞快速增殖^[13]。在肺癌中IGF2BP2通过m6A修饰提高FLT4RNA的稳定性，加速肿瘤微环境血管生成，促进肺癌的侵袭转移^[28]。IGF2BP2作为m6A修饰的关键阅读器，在多种肿瘤中通过调控不同的靶基因及代谢通路，推动肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。在胰腺癌的研究中，已有研究分别利用GEO和TCGA数据库探讨IGF2BP2的高表达及其与胰腺癌生物学行为的关系。例如，一项研究^[29]通过GEO数据集发现IGF2BP2在胰腺癌组织中较癌旁组织高表达，并通过TGF-β诱导的上皮-间充质转化实验推测IGF2BP2与胰腺癌上皮-间充质转化过程密切相关。另有研究^[30-31]利用TCGA数据集探讨了IGF2BP2对lncRNA DANCR的表达和稳定性调控，进而促进胰腺癌细胞的增殖。与以往依赖单一数据库的研究相比，本研究通过整合多个公共数据库（TCGA、GTEX、GEO）的数据，使分析结果更具可靠性和广泛代表性。在此基础上，通过体外实验进一步验证了IGF2BP2对胰腺癌细胞的影响，结果显示，敲除IGF2BP2后，CCK-8检测显示胰腺癌细胞的增殖能力显著下降，流式细胞周期分析表明大部分癌阻滞在G0~G1期，平板克隆形成实验则显示克隆形成能力显著减弱。此外，细胞迁移能力也受到显著抑制。这些结果表明，IGF2BP2在胰腺癌细胞增殖、迁移及细胞周期调控中发挥了重要作用。

综上所述，m6A阅读器IGF2BP2在胰腺癌组织中呈高表达，且与胰腺癌患者不良预后密切相关，其作用机制可能与促进癌细胞生长与迁移有关，IGF2BP2有望成为胰腺癌的生物标志物及潜在治疗靶点，为胰腺癌的治疗提供新途径。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82000614)

湖南省自然科学基金资助项目(2021JJ70051)

湖南省自然科学基金资助项目(2024JJ5533)

湖南省卫生健康委科研计划资助项目(202204015341)

中南大学湘雅三医院汇智育才基金资助项目(YX202203)