长链非编码RNA FGD5-AS1调控miR-142-3p/PDK1信号轴在胃癌中的作用及机制

The function and mechanism of long non-coding RNA FGD5-AS1 in regulating the miR-142-3p/PDK1 signaling axis in gastric cancer

摘要

背景与目的 研究显示，长链非编码RNA（lncRNA）FGD5-AS1在胃癌（GC）中发挥致癌基因的作用。笔者前期通过生物信息学分析发现，FGD5-AS1与微小RNA-142-3p（miR-142-3p）、miR-142-3p与丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）之间存在结合位点。因此，本研究探讨FGD5-AS1靶向miR-142-3p/PDK1对GC细胞中的表达及作用。 方法 利用双荧光素酶报告基因实验验证FGD5-AS1与miR-142-3p、miR-142-3p与PDK1之间的靶向关系。采用qRT-PCR检测GC组织中FGD5-AS1、miR-142-3p和PDK1的表达水平。构建sh-FGD5-AS1干扰体系及miR-142-3p抑制模型，分别或联合转染GC细胞系BGC823，观察细胞增殖（CCK8、EdU）、凋亡（流式细胞术）、迁移与侵袭（Transwell）等生物学行为及相关蛋白表达（Western blot）。通过裸鼠皮下成瘤实验检测FGD5-AS1对GC移植瘤生长的影响。 结果 双荧光素酶报告基因实验显示，miR-142-3p mimic可明显降低FGD5-AS1和PDK1野生型（WT）报告基因的荧光活性（均P<0.05），而对突变型（MUT）无影响，证实FGD5-AS1与miR-142-3p、miR-142-3p与PDK1之间存在直接结合关系。敲除FGD5-AS1后，GC细胞中miR-142-3p表达上调，PDK1表达下调，细胞增殖、迁移、侵袭能力减弱，凋亡增强，上述变化可被miR-142-3p抑制剂逆转（均P<0.05）。动物实验显示敲除FGD5-AS1可明显抑制裸鼠移植瘤的生长及移植瘤组织中Ki-67、PDK1表达（均P<0.05）。 结论 FGD5-AS1可能通过ceRNA机制靶向吸附miR-142-3p，从而解除对PDK1的抑制，促进GC细胞的增殖与侵袭，并加速肿瘤生长。FGD5-AS1/miR-142-3p/PDK1轴在GC发生发展中发挥关键作用，或可作为潜在的诊疗靶点。

Abstract

Background and Aims Studies have shown that the long non-coding RNA (lncRNA) FGD5-AS1 functions as an oncogene in gastric cancer (GC). Our previous bioinformatics analysis revealed potential binding sites between FGD5-AS1 and microRNA-142-3p (miR-142-3p), as well as between miR-142-3p and pyruvate dehydrogenase kinase 1 (PDK1). Therefore, this study aimed to investigate the expression and functional role of the FGD5-AS1/miR-142-3p/PDK1 axis in GC cells. Methods Dual-luciferase reporter assays were used to verify the targeting relationships between FGD5-AS1 and miR-142-3p, and between miR-142-3p and PDK1. qRT-PCR was conducted to measure the expression levels of FGD5-AS1, miR-142-3p, and PDK1 in GC tissues. A knockdown model of FGD5-AS1 (sh-FGD5-AS1) and an miR-142-3p inhibitor were constructed and transfected, alone or in combination, into BGC823 GC cells. Cellular behaviors, including proliferation (CCK8, EdU), apoptosis (flow cytometry), migration, and invasion (Transwell assays), were assessed, along with related protein expression (Western blot). A subcutaneous xenograft model in nude mice was used to evaluate the effect of FGD5-AS1 on tumor growth in vivo. Results The dual-luciferase assays demonstrated that miR-142-3p mimics significantly reduced the luciferase activity of wild-type (WT) FGD5-AS1 and PDK1 reporters (both P<0.05), but had no effect on mutant (MUT) reporters, confirming a direct binding relationship. Knockdown of FGD5-AS1 led to upregulation of miR-142-3p and downregulation of PDK1 in GC cells, with reduced proliferation, migration, and invasion, and enhanced apoptosis (all P<0.05); these effects were reversed by the miR-142-3p inhibitor. In vivo, FGD5-AS1 knockdown significantly inhibited tumor growth in nude mice and decreased Ki-67 and PDK1 expression in tumor tissues (all P<0.05). Conclusion FGD5-AS1 may act as a ceRNA that sponges miR-142-3p, thereby relieving its suppression on PDK1, and promoting GC cell proliferation and invasion as well as tumor progression. The FGD5-AS1/miR-142-3p/PDK1 axis plays a critical role in the development of GC and may serve as a potential therapeutic target.

Graphical abstract

关键词

胃肿瘤 / RNA，长链非编码 / 微RNAs / 丙酮酸脱氢酶激酶1 / 肿瘤侵润

Key words

Stomach Neoplasms / RNA, Long Noncoding / MicroRNAs / Pyruvate Dehydrogenase Kinase 1 / Neoplasm Invasiveness

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上消化道恶性肿瘤的第二大病因，超过70%的GC新发和死亡病例发生在发展中国家，其中中国约占全球GC新发病例的42%^[1-2]。虽然近几十年来手术技术、免疫治疗、分子靶向治疗等领域取得了一定的进展，但由于对GC发生的细胞和分子水平的具体机制知之甚少^[3]，治疗效果仍不佳。因此，阐明GC发病的分子机制，寻找有希望、有效的GC诊断和治疗靶点具有重要意义。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）被广泛报道为竞争内源性RNA（ceRNA），ceRNA可以通过结合微小RNA（miRNA）反应元件调控miRNA引起的基因沉默，与GC在内的许多肿瘤的发展和癌变有关^[4-5]。在众多lncRNA中，FGD5-AS1因其对肿瘤发生和发展的影响引起了广泛的关注，研究发现lncRNA FGD5-AS1在GC、口腔癌、肝细胞癌等多种癌症中表达上调^[6]。miRNA海绵是lncRNA在调节癌症发展中的关键，相关研究显示miR-142-3p在GC中表达下调^[7]。丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）是一种重要的糖酵解酶，可以磷酸化和灭活丙酮酸脱氢酶，从而抑制丙酮酸氧化且已被发现与癌细胞的增殖、转移和化疗耐药密切相关^[8]。笔者前期通过生物信息学研究发现，FGD5-AS1与miR-142-3p、miR-142-3p与PDK1之间存在结合位点。因此，本研究探讨FGD5-AS1靶向miR-142-3p/PDK1对GC细胞中的表达及作用，以期为GC的治疗提供新靶点和策略。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

BALB/c裸鼠[许可证号：SCXK（鄂）2022-0013，武汉生物制品研究所有限责任公司]；BGC823细胞（货号：SHC782，南京赛泓瑞生物科技有限公司）；M-MLV-RTase试剂盒（货号：CYZ-C15021，艾美捷科技有限公司）；总RNA提取试剂盒（货号：QPE-011，上海吉玛制药技术有限公司）；qRT-PCR试剂盒（货号：T427，广州英赞生物科技有限公司）；CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒（货号：R2740，北京康瑞纳生物科技有限公司）；EdU细胞增殖检测试剂盒（货号：C10338，广州市锐博生物科技有限公司）；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（货号：APOAF，上海益启生物科技有限公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：GM-040502，上海吉满生物科技有限公司）；GAPDH、PDK1、Ki-67、PCNA、cleaved caspase-3、MMP-9、HRP（货号：ab128915、ab202468、ab16667、ab92552、ab32042、ab228402、ab6721，英国Abcam公司）；引物由上海经科化学科技有限公司合成；qRT-PCR（型号：ABI 2720，美国ABI公司）；倒置显微镜（型号：Revolve，广州德瑞科仪科技有限公司）；流式细胞仪（型号：Navios EX，上海贝克曼库尔特国际贸易有限公司）。

1.2 临床样本

收集30例在首都医科大学附属北京安贞医院进行手术治疗的GC患者（2023年9月—2024年6月）的癌组织样本和癌旁组织标本。经本院伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 双荧光素酶报告基因实验

将含miR-142-3p结合位点的FGD5-AS1和PDK1野生型（WT）和突变型（MUT）的报告基因质粒克隆到pmiRGLO载体，分别与mimic-NC和miR-142-3p mimic共转染到BGC823细胞中，转染24 h后，用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

1.3.2 qRT-PCR法检测FGD5-AS1、miR-142-3p、PDK1 mRNA的表达

利用RNA提取试剂盒GC组织和癌旁组织总RNA，验证RNA纯度后，利用M-MLV-RTase试剂盒逆转录cDNA，lncRNA FGD5-AS1、PDK1以GAPDH作为内参，miR-142-3p以U6作为内参，进行qRT-PCR，据2^-∆∆Ct计算mRNA的表达。引物序列见表1。

1.3.3 细胞转染

将BGC823细胞随机分为空白对照组（正常培养）、sh-NC组（转染sh-阴性对照）、sh-FGD5-AS1组（转染sh-FGD5-AS1）、sh-FGD5-AS1+inhibitor-NC组（转染sh-FGD5-AS1+inhibitor-阴性对照）、sh-FGD5-AS1+miR-142-3p inhibitor组（转染sh-FGD5-AS1+miR-142-3p inhibitor）。每组实验重复3次，每次2个平行。

1.3.4 CCK8法和EdU染色检测BGC823细胞增殖

CCK8法：将5×10³个/孔BGC823细胞接种于含有10% FBS的完整培养基的96孔板中，悬浮细胞贴壁8 h后，加入10 μL CCK8试剂（10%）的CCK8溶液孵育40 min，用酶标仪检测450 nm处OD值，该值表示细胞的增殖情况。EdU染色法：将6× 10³个/孔BGC823细胞接种于96孔板，培养过夜，每孔细胞在含有50 µmol EdU的100 µL培养基中孵育2 h，4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton X-100的PBS清洗10 min，并用100 µL Apollo染色缓冲液在黑暗中染色，样品在荧光显微镜下成像。

1.3.5 流式细胞仪检测对BGC823细胞凋亡

收集处理后的BGC823细胞，重悬于200 µL结合缓冲液中，用10 µL Annexin V-FITC和5 µL PI在室温下黑暗处理15 min，加入300 µL结合缓冲液后，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6 Transwell实验检测BGC823细胞迁移和侵袭

为了进行侵袭试验，在Transwell上室中添加培养基之前，先用100 μL Matrigel基质胶涂30 min，转染后的BGC823细胞以1×10⁶个/mL在无血清培养基中重悬，上室加100 μL细胞悬浮培养基，下腔加含血清培养基600 μL，37 ℃，5% CO₂孵育24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，通过滤光片的细胞用倒置荧光显微镜拍照和计数。

1.3.7 Western blot检测BGC823细胞中PDK1、PCNA、cleaved caspase-3、MMP-9蛋白的表达

RIPA裂解法提取BGC823细胞总蛋白，蛋白浓度检测采用BCA法，等量的蛋白质按照常规方法用SDS-PAGE凝胶分离，将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上，然后PVDF膜在5% BSA-TBST中室温封闭2 h，加入GAPDH（1∶10 000）、PDK1（1∶2 000）、PCNA（1∶1 000）、cleaved caspase-3（1∶500）、MMP-9（1∶1 000）一抗在4 ℃下过夜，用TBST洗涤10 min，重复3次，室温下接种二抗（1∶2 000）1 h，再次洗涤后，用超灵敏ECL试剂盒对膜进行显像，根据ImageJ测试的条带强度计算蛋白表达水平。

1.3.8 动物实验

4周龄BALB/c雄性裸鼠（20±0.4）g置于SPF条件下培养，获得稳定转染的sh-FGD5-AS1（sh-FGD5-AS1组）和sh-NC（sh-NC组）BGC823细胞，皮下注射0.1 mL 1×10⁶个细胞，28 d后异氟醚麻醉小鼠并处死，切除肿瘤，测量肿瘤重量和体积。本实验通过本院动物委员会批准。

1.3.9 免疫组化法检测裸鼠GC肿瘤组织Ki-67、PDK1蛋白的表达

GC肿瘤组织用10%福尔马林溶液固定，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水化，室温孵育10 min，加入0.01 mol/L柠檬酸盐后，经微波提取抗原20 min，并与正常山羊血清在室温下孵育5 min，组织与PDK1（1∶1 000）、Ki-67（1∶250）一抗在4 ℃下孵育过夜。然后，将组织与二抗（1∶1 000）在37 ℃下孵育30 min，用DAB培养1~2 min，用苏木精反染观察。

1.4 统计学处理

数据用SPSS 25.0分析，计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较行SNK-q检验，两组间比较行独立样本t检验进行。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 FGD5-AS1和miR-142-3p、miR-142-3p和PDK1的靶向关系分析

笔者前期使用Starbase网站分析显示，FGD5-AS1与miR-142-3p、miR-142-3p和PDK1之间存在结合位点（图1）。本研究中，进一步采用双荧光素酶报告基因实验验证，结果显示，在转染FGD5-AS1-WT和转染PDK1-WT的BGC823细胞中，miR-142-3p mimic组的荧光素酶活性降低（均P<0.05）（表2）。

2.2 GC组织中FGD5-AS1、miR-142-3p、PDK1的表达

30例临床样本中，与癌旁组织比较，GC组织FGD5-AS1、PDK1表达明显升高，miR-142-3p表达明显降低（均P<0.05）（图2）。

2.3 各组BGC823细胞中FGD5-AS1、miR-142-3p、PDK1 mRNA的表达情况

sh-FGD5-AS1组FGD5-AS1、PDK1 mRNA低于sh-NC组、空白对照组，miR-142-3p表达高于sh-NC组、空白对照组（均P<0.05）；与sh-FGD5-AS1组、sh-FGD5-AS1+inhibitor-NC组相比，sh-FGD5-AS+miR-142-3p inhibitor组miR-142-3p表达降低，PDK1 mRNA表达升高（均P<0.05）（图3）。

2.4 各组BGC823细胞的增殖情况

sh-FGD5-AS1组OD₄₅₀值、EdU阳性细胞率均明显低于sh-NC组、空白对照组（均P<0.05）；与sh-FGD5-AS1组、sh-FGD5-AS1+inhibitor-NC组比较，sh-FGD5-AS1+miR-142-3p inhibitor组BGC823细胞的OD₄₅₀值、EdU阳性细胞率均明显升高（均P<0.05）（图4）。

2.5 各组BGC823细胞的凋亡情况

sh-FGD5-AS1组凋亡率高于sh-NC组、空白对照组（均P<0.05）；与sh-FGD5-AS1组、sh-FGD5-AS1+inhibitor-NC组相比，sh-FGD5-AS1+miR-142-3p inhibitor组凋亡率均降低（均P<0.05）（图5）。

2.6 各组BGC823细胞迁移、侵袭能力

sh-FGD5-AS1组迁移数、侵袭数明显低于sh-NC组、空白对照组（均P<0.05）；与sh-FGD5-AS1组、sh-FGD5-AS1+inhibitor-NC组比较，shFGD5-AS1+miR-142-3p inhibitor组迁移数、侵袭数均明显升高（均P<0.05）（图6）。

2.7 各组BGC823细胞中PDK1、PCNA、cleaved caspase-3、MMP-9蛋白表达

sh-FGD5-AS1组PDK1、PCNA、MMP-9蛋白表达低于sh-NC组、空白对照组，cleaved caspase-3蛋白表达高于sh-NC组、空白对照组（均P<0.05）；与sh-FGD5-AS1组、sh-FGD5-AS1+inhibitor-NC组比较，sh-FGD5-AS1+miR-142-3p inhibitor组PDK1、PCNA、MMP-9蛋白表达升高，cleaved caspase-3蛋白表达降低（均P<0.05）（图7）。

2.8 敲除FGD5-AS1对裸鼠移植瘤生长的影响

与sh-NC组比较，sh-FGD5-AS1组移植瘤体积、质量、Ki-67阳性率、PDK1阳性率均明显降低（均P<0.05）（图8-9）。

3 讨　论

GC是一种异质性疾病，由表观遗传改变的逐渐积累诱发，导致致癌和抗癌途径不平衡^[9]。尽管在过去几年中GC的诊断和治疗取得了实质性进展，但GC患者的病死率仍然很高，特别是在疾病晚期或转移的患者中。晚期胃部肿瘤经常转移到身体的邻近甚至远处器官，如肝脏、肺、骨骼或淋巴结，从而给GC患者带来预后不良和治疗选择有限的负担^[10]。大多数癌症的死亡原因不是原发肿瘤，而是肿瘤转移，约90%的癌症相关死亡是由肿瘤转移引起的^[11]。GC细胞的恶性生物行为，如增殖、侵袭、转移的分子机制促进了GC的进展，分子靶向治疗被认为是GC最有前途的治疗方法之一，然而，治疗GC的挑战不仅包括肿瘤的转移和复发，还包括不确定和非特异性的治疗靶点^[12]。因此，寻找GC的有效治疗靶点可能为GC的精准治疗提供丰富的理论依据。

lncRNA参与调控细胞的增殖、转移、分化、炎症、血管生成在多种癌症的进展中发挥重要作用^[13]。研究^[14]发现，FGD5-AS1在宫颈癌中高表达，FGD5-AS1通过靶向下游miRNA/mRNA轴促进宫颈癌细胞的恶性生物学行为和化疗耐药性。此外，研究^[15]表明，lncRNA FGD5-AS1在胰腺癌中高表达，其过表达过靶向下游miRNA/mRNA轴促进胰腺癌细胞的增殖、迁移。提示FGD5-AS1在多种癌症中发挥促癌基因的作用，且其机制可能是介导miRNA/mRNA信号通路实现的。此外，多项研究发现FGD5-AS1通过调控miRNA/mRNA信号通路参与GC的进展^[16]。Feng等^[17]发现，FGD5-AS1在GC组织中高表达，且FGD5-AS1高表达的GC患者发生淋巴转移或远处转移的风险高于表达水平低的GC患者，预后较差，FGD5-AS1通过靶向负调控FZD3促进GC的增殖和转移。Qin等^[18]发现，FGD5-AS1过表达与GC淋巴结转移相关，并预示GC患者生存期较差，FGD5-AS1过表达通过结合和稳定YBX1蛋白抑制细胞衰老和活性氧产生，从而促进GC进展。Gao等^[19]发现，GC细胞系和人肿瘤样本均显示FGD5-AS1异常上调，FGD5-AS1通过调控miR-153-3p/CITED2信号通路，促进GC细胞的增殖、化疗耐药性和体内致瘤性。本研究发现敲除FGD5-AS1可以抑制GC细胞的增殖、迁移，促进细胞凋亡，抑制GC移植瘤的生长，提示FGD5-AS1通过在体外促进GC细胞的恶性生物学行为，在体内促进移植瘤生长，促进GC的进展。

miRNA可通过直接结合靶基因的3'UTR来抑制靶基因的生物学功能，参与了广泛的生物学过程，可以调节GC的进展和化疗耐药性^[20-21]。Dong等^[22]发现，miR-142-3p可以抑制宫颈癌细胞的增殖，是通过负向调节HMGB1的胞质定位实现的。Ma等^[23]发现，miR-142-3p在三阴性乳腺癌中低表达，LINC00689通过负调控miR-142-3p促进USP6NL的表达，促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化，抑制细胞的凋亡。Cui等^[24]发现，miR-142-3p在肝细胞癌中低表达，lncRNA lnc712通过靶向miR-142-3p/Bach-1轴促进肝细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期，从而抑制肝细胞癌的生长。提示miR-142-3p在多种癌症中发挥抑癌基因的作用，并受上游lncRNA的调控，并可以调控下游mRNA，进而参与调控癌症的进展。Wang等^[25]发现，GC组织中miR-142-3p低表达，miR-142-3p可下调CCNT2抑制GC细胞的增殖、侵袭和迁移。Ma等^[26]发现，miR-142-3p通过靶向丝裂原活化蛋白激酶复合1抑制烟曲霉激活的CD4 T细胞中IFN-γ的生成，进而抑制GC的疾病。本研究发现FGD5-AS1与miR-142-3p之间存在结合位点，抑制miR-142-3p可以逆转敲除FGD5-AS1对GC细胞恶性生物学行为的抑制作用，提示FGD5-AS1可能通过海绵化miR-142-3p促进GC的进展。

大多数癌细胞主要通过高速率的糖酵解产生能量，随后是乳酸发酵，即使在充足的氧气存在下，PDK1是一种通过磷酸化和灭活丙酮酸脱氢酶复合物负责有氧糖酵解的酶，在多种肿瘤中高表达^[27]。You等^[28]发现，SDC2过表达激活了GC中Akt信号通路，其机制是通过SDC2与PDK1-ph结构域相互作用，从而促进PDK1膜易位促进Akt活化，促进GC的进展。Ba等^[29]发现，PDK1在转移性GC组织中表达上调，lncRNA AC093818.1通过表观遗传促进PDK1表达，在体外和体内促进GC的迁移和侵袭。Guo等^[30]发现，MeCP2通过与启动子区的CpG位点结合来提高PDK-1的表达，调节GC细胞中顺铂的耐药性。本研究发现，miR-142-3p与PDK1之间存在结合位点，据此推测FGD5-AS1可能通过海绵化miR-142-3p上调PDK1的表达，抑制GC细胞的增殖、侵袭，促进细胞凋亡，抑制GC裸鼠移植瘤生长，可能作为GC的潜在治疗靶点。

综上所述，敲除FGD5-AS1可以抑制GC细胞的增殖、侵袭，促进细胞凋亡，抑制GC裸鼠移植瘤生长，其机制可能是靶向miR-142-3p/PDK1信号轴实现的FGD5-AS1/miR-142-3p/PDK1信号通路可能作为GC的潜在治疗靶点。然而，本研究局限于FGD5-AS1/miR-142-3p/PDK1信号通路，后续会关注更多靶点，深入研究。

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