巨噬细胞富集lncRNA CCL3-AS1在颈动脉斑块不稳定中的表达及作用机制

Expression and mechanistic role of macrophage-enriched lncRNA CCL3-AS1 in carotid plaque instability

摘要

背景与目的 颈动脉斑块不稳定性是缺血性脑卒中发生的重要病理基础，寻找关键分子标志物以评估斑块稳定性具有重要临床意义。近年来的研究强调了长链非编码RNA（lncRNA）在斑块稳定性中的重要调控作用和预警价值。笔者前期对人颈动脉稳定和不稳定斑块组织进行全转录组测序，发现lncRNA 趋化因子3反义RNA 1（CCL3-AS1）在不稳定斑块中高表达，可能与斑块稳定性密切相关。因此，本研究进一步扩大斑块组织样本量验证，并探讨CCL3-AS1对颈动脉斑块稳定性的影响及分子机制。 方法 收集颈动脉内膜剥脱术患者的斑块组织，HE和天狼星红等病理染色方法将其分为稳定斑块组和不稳定斑块组（n=15/组），采用qRT-PCR对候选的差异lncRNA CCL3-AS1的表达进行验证。用RNA原位杂交联合免疫荧光技术确定其在斑块组织中的定位及与巨噬细胞的共表达关系。体外实验中，通过慢病毒或反义寡核苷酸（ASO）分别上调或敲低THP1来源巨噬细胞中CCL3-AS1表达，检测炎症因子及基质金属蛋白酶（MMP）的变化。体内通过载脂蛋白E敲除（ApoE^-/-）小鼠右颈动脉串联结扎构建不稳定斑块模型，并局部过表达CCL3-AS1，评估其对斑块形态、炎性巨噬细胞浸润及MMP-9表达的影响。进一步基于catRAPID omics v2.1平台进行生物信息学预测，筛选CCL3-AS1潜在结合蛋白，并结合RNA稳定性实验与RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验，验证其调控MMP-9表达的机制。 结果 结果显示，CCL3-AS1在不稳定颈动脉斑块中呈明显高表达，并主要定位于斑块中巨噬细胞的胞浆。体外实验显示，CCL3-AS1过表达可明显上调巨噬细胞中MCP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS及MMP-9的表达，敲低则相反。在ApoE^-/-小鼠的颈动脉不稳定斑块模型中，CCL3-AS1过表达诱导斑块纤维帽破裂、炎性巨噬细胞聚集及MMP-9分泌增强，促进斑块不稳定。共表达分析提示CCL3-AS1与MMP-9表达高度相关（r=0.89，P=0.001），RNA稳定性实验显示其可延缓MMP-9 mRNA降解。生物信息学预测发现CCL3-AS1可能与hnRNP-K蛋白结合，RIP实验和组织FISH共定位进一步证实该相互作用，提示CCL3-AS1通过与hnRNP-K结合增强MMP-9 mRNA稳定性，进而促进其表达。 结论 lncRNA CCL3-AS1作为巨噬细胞中富集的炎症调控因子，可能通过hnRNP-K介导的MMP-9表达促进颈动脉斑块不稳定，为缺血性脑卒中的早期干预和分子分型提供潜在靶点。

Abstract

Background and Aims Carotid plaque instability is a critical pathological basis for ischemic stroke. Identifying key molecular markers to evaluate plaque stability has important clinical implications. Recent studies have emphasized the regulatory roles and predictive value of long non-coding RNAs (lncRNAs) in plaque stability. In our previous transcriptome sequencing analysis of human stable and unstable carotid plaques, we identified lncRNA C-C motif chemokine ligand 3 antisense RNA 1(CCL3-AS1) as significantly upregulated in unstable plaques, suggesting a potential association with plaque instability. Therefore, this study aimed to validate CCL3-AS1 expression in an expanded plaque sample cohort and to explore its role and underlying molecular mechanism in carotid plaque destabilization. Methods Carotid plaque specimens were obtained from patients undergoing carotid endarterectomy and classified into stable and unstable groups (n=15 per group) based on HE and Sirius red staining. qRT-PCR was used to validate the expression of candidate lncRNA CCL3-AS1. The localization and co-expression of CCL3-AS1 with macrophages in plaques were determined by RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) combined with immunofluorescence staining. In vitro, THP1-derived macrophages were transduced with lentivirus or treated with antisense oligonucleotides (ASO) to overexpress or knock down CCL3-AS1, respectively, and the expression levels of inflammatory cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs) were assessed. In vivo, an unstable carotid plaque model was established by tandem ligation of the right carotid artery in apolipoprotein E-deficient (ApoE^-/-) mice, followed by local overexpression of CCL3-AS1. The effects on plaque morphology, macrophage infiltration, and MMP-9 expression were evaluated. Additionally, bioinformatic prediction using the catRAPID v2.1 omics platform was performed to identify potential RNA-binding proteins interacting with CCL3-AS1. RNA stability assays and RNA-binding protein immunoprecipitation (RIP) were conducted to verify the regulatory mechanism of MMP-9 expression. Results CCL3-AS1 was significantly upregulated in unstable carotid plaques and was predominantly localized to the cytoplasm of plaque-infiltrating macrophages. In vitro, overexpression of CCL3-AS1 markedly increased the expression of MCP-1, TNF-α, IL-1β, iNOS, and MMP-9 in macrophages, whereas knockdown had the opposite effect. In the ApoE^-/- mouse model of unstable carotid plaques, CCL3-AS1 overexpression led to fibrous cap rupture, increased infiltration of pro-inflammatory macrophages, enhanced MMP-9 secretion, and promoted plaque instability. Co-expression analysis revealed a strong correlation between CCL3-AS1 and MMP-9 expression (r=0.89, P=0.001). RNA stability assays demonstrated that CCL3-AS1 delayed the degradation of MMP-9 mRNA. Bioinformatic prediction identified heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K (hnRNP-K) as a potential binding partner of CCL3-AS1. RIP and FISH co-localization confirmed the interaction, suggesting that CCL3-AS1 enhances MMP-9 mRNA stability through binding to hnRNP-K, thereby promoting its expression. Conclusion As a macrophage-enriched inflammatory lncRNA, CCL3-AS1 may promote carotid plaque instability by enhancing MMP-9 expression via hnRNP-K-mediated mRNA stabilization. This lncRNA represents a potential molecular target for early intervention and stratification of ischemic stroke.

Graphical abstract

关键词

斑块，动脉粥样硬化 / 颈动脉 / RNA，长链非编码 / 巨噬细胞

Key words

Plaque, Atherosclerotic / Carotid Arteries / RNA, Long Noncoding / Macrophages

我国已进入“深度老龄化”阶段，衰老相关心脑血管疾病的发病率和病死率仍居首位，其中动脉粥样硬化性疾病（如脑卒中、冠心病等）以其高致死和高致残性造成了沉重的经济和社会负担。越来越多的证据^[1-2]表明，颅外颈动脉斑块不稳定与脑卒中发生风险增加相关，而非狭窄程度。颈动脉内膜剥脱术是治疗颈动脉狭窄、预防缺血性卒中的主要手段，其核心是通过切除增厚的动脉内膜和粥样硬化斑块，恢复血管通畅性^[3-4]。部分患者由于高龄化或弥漫性血管病变无法耐受手术^[5]。因此，深入解析颈动脉斑块不稳定的分子机制、寻找无创预警的分子标志物有助于对颈动脉粥样硬化患者进行风险分层、精准实施颈动脉内膜剥脱手术，降低脑卒中发病风险。

动脉粥样硬化斑块是否破裂取决于其内在组织成分和外在表面应力，大脂质核心、薄纤维帽、活动性炎症、点状钙化和凝血机制增强等是不稳定斑块的突出特点。与稳定斑块相比，破裂斑块纤维帽处存在大量巨噬细胞浸润，炎症反应更加活跃，并伴随基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）分泌^[6]。MMP，尤其是MMP-9过表达会降解纤维帽胶原，促进斑块破裂^[7]。因此，巨噬细胞激活和活动性炎症是导致斑块不稳定乃至破裂的重要因素，但机制还未完全阐明。

目前，对于斑块易损性的客观诊断标准尚未统一，病理诊断仍然是最可靠的评估手段，亟须开发更多无创诊断技术^[8]。近年来研究^[9-10]表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要的调控作用，可能作为鉴别和预测斑块稳定性的关键分子标志物。笔者团队前期根据病理学特征，将收集的颈动脉内膜剥脱术患者的斑块组织分为稳定斑块组和不稳定斑块组进行全转录组测序，筛选与斑块稳定性相关的差异lncRNA，发现趋化因子3反义RNA 1（C-C motif chemokine ligand 3 antisense RNA 1，CCL3-AS1）可能与斑块稳定性密切相关。本研究进一步扩大斑块组织样本量验证，并利用团队前期构建的小鼠颈动脉斑块不稳定模型^[11-12]，深入解析目标lncRNA的生物学功能，以期为预测和治疗颈动脉斑块不稳定性提供新的分子标志。

1 材料与方法

1.1 实验材料

载脂蛋白E敲除（apolipoprotein E-deficient，ApoE^-/-）小鼠（维通利华，中国），高脂饮食（Research Diets，#D12492，美国），慢病毒（吉凯基因，中国），反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）（锐博生物，中国），核内不均一核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP-K）抗体（#ab39975）、CD68抗体（#ab213363）、F4/80抗体（#ab6640）、MMP-9抗体（#ab283575）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase 2，iNOS）抗体（#ab178945）均来自Abcam公司，cleaved casepase3抗体（CST，#9661，美国），Magna RIP™ RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit试剂盒（Millipore，#17-700，美国），Fluorescent In Situ Hybridization Kit（FISH试剂盒）（锐博生物，#C10910，中国），Masson染色试剂盒、天狼星红染色试剂盒和佛波酯（Sigma-Aldrich，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 人颈动脉斑块组织学染色

收集人颈动脉内膜剥脱术患者的斑块组织，通过HE染色和天狼星红染色鉴定斑块结构和稳定性情况。将大脂质核心、薄纤维帽、Ⅲ型胶原比例减少等特征判断斑块处于不稳定状态。CD68免疫荧光染色鉴定斑块巨噬细胞浸润情况，RNA FISH检测CCL3-AS1的分布情况及与CD68巨噬细胞、hnRNP-K蛋白的共定位情况。

1.2.2 小鼠颈动脉不稳定斑块模型构建和组织学染色

笔者前期建立了ApoE^-/-小鼠的颈动脉不稳定斑块模型^[12]，其颈动脉斑块表现出不稳定的动脉粥样硬化病变，类似于人易损、易破裂的颈动脉斑块。简单来说，选取6周龄雄性ApoE^-/-小鼠30只，高脂饮食喂养6周，注射氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）进行麻醉，进行右颈动脉串联结扎手术。右颈动脉分叉处引入直径为160 µm的针，在位于分叉处远端1 mm处以及远端狭窄的近端点3 mm处使用6-0的黑色聚酯纤维缝合线结扎，随后将针移除。采用局部浸润慢病毒的方式过表达CCL3-AS1，10 min后缝合伤口，继续高脂喂养4周后取材。取小鼠右颈动脉近端颈动脉Ⅱ段，做冷冻切片，分析CCL3-AS1对斑块稳定性的影响。Masson染色检测斑块纤维帽胶原含量，分析血栓形成类型（斑块内血栓、血管腔内血栓）、纤维帽完整性和有无破裂。免疫荧光染色鉴定巨噬细胞浸润情况：F4/80抗体染色鉴定斑块内巨噬细胞总量，iNOS抗体染色鉴定炎性巨噬细胞，cleaved casepase-3抗体染色鉴定凋亡巨噬细胞，MMP-9抗体染色检测巨噬细胞的MMP-9分泌情况。

1.2.3 细胞培养

人THP1单核/巨噬细胞系培养：用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养。THP1细胞在100 ng/mL佛波酯刺激48 h后分化成M0巨噬细胞。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）和人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cell，HAEC）使用内皮细胞专用培养基，人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cell，HASMC）使用平滑肌细胞专用培养基。慢病毒感染THP1细胞（MOI=50），获得稳定过表达CCL3-AS1细胞系。给予巨噬细胞ASO（50 nmol/L）以降低CCL3-AS1表达水平。通过观察巨噬细胞炎症因子及MMP表达、亚型分化、脂质吞噬和凋亡情况，明确CCL3-AS1在巨噬细胞炎性活动中的调控作用。

1.2.4 qRT-PCR

采用TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国）提取细胞或组织的总RNA，使用 PrimeScript逆转录酶试剂盒（Takara公司，美国）合成 cDNA，使用SYBR Green qPCR Mix（YEASEN公司，中国）对CCL3-AS1、单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素1β（interleukin 1 beta，IL-1β）、iNOS和CCL3基因进行PCR扩增，使用ABI QuantStudio Dx仪器（Life Technologies公司，美国）进行基因实时荧光定量检测。熔解曲线分析中的单峰表明扩增产物具有特异性。以β-actin作为内参基因来校正其他基因mRNA水平，并采用2^-ΔΔCt法进行比较。qRT-PCR的基因特异性引物序列见表1。

1.2.5 RNA稳定性实验

将稳定过表达CCL3-AS1的THP1细胞系（Lv-CCL3-AS1）及对照细胞系（Lv-NC）接种于12孔板，佛波酯刺激48 h诱导单核细胞分化为巨噬细胞，加入10 μg/mL放线菌素D，分别在0、4、8、12、24 h收集细胞，使用qRT-PCR法检测MMP-9 mRNA表达水平。

1.2.6 RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-protein immunoprecipitation，RIP）

收集Lv-CCL3-AS1和Lv-NC组巨噬细胞，使用Magna RIP™ RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit试剂盒进行RNA蛋白复合物免疫沉淀。简单来说，在细胞裂解物中加入5 μg hnRNP-K抗体孵育过夜，加入protein A/G磁珠孵育8 h，使用磁力架收集与hnRNP-K结合的RNA复合物，qRT-PCR法检测CCL3-AS1和MMP水平，以验证三者是否存在相互作用。

1. 3 统计学处理

实验数据统计分析均使用GraphPad Prism v10.4.2完成。数据均进行Shapiro-Wilk正态性检验，两组符合正态分布的数据采用非配对双尾t检验；非正态分布的数据，采用Mann-Whitney U检验；两组多个时间点连续数据的显著性检验采用两因素方差分析进行组间差异比较；采用Spearman分析非正态分布数据间的相关性。计量资料均采用均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 lncRNA CCL3-AS1在人颈动脉不稳定斑块的巨噬细胞中高表达

前期对人颈动脉稳定和不稳定斑块组织进行全转录组测序，发现lncRNA CCL3-AS1在不稳定斑块中高表达，上调达5.1倍（P=0.013）（图1A）；本次研究进一步扩大样本验证表明，CCL3-AS1在颈动脉不稳定斑块中上调3.3倍（P=0.016）（图1B）。CCL3-AS1（NCBI Gene ID：102724850）与编码基因CCL3转录方向相反，位于17号染色体，全长646 bp，目前该lncRNA尚无功能注释（图1C）。组织学染色显示人不稳定颈动脉斑块具有较大的脂质核心、较薄的纤维帽、Ⅲ型胶原减少和炎性细胞浸润增加等易损斑块特征（图2A）。RNA FISH染色结果显示CCL3-AS1主要富集在不稳定斑块的巨噬细胞中（图2B-C）。在体外培养的血管细胞中（包括HUVEC、HAEC、HASMC、THP1和THP1-M0细胞），CCL3-AS1在THP1单核细胞以及单核来源的巨噬细胞（THP1-M0）中高度表达（图2D）。亚细胞定位显示，CCL3-AS1主要表达于炎症反应活跃的巨噬细胞胞浆中（图2E）。以上结果提示CCL3-AS1富集在斑块的巨噬细胞中，可能通过调控巨噬细胞炎性影响颈动脉斑块稳定性。

2.2 CCL3-AS1促进巨噬细胞炎性活动和MMP-9表达，加速斑块不稳定

体外研究表明慢病毒介导CCL3-AS1过表达，显著上调巨噬细胞炎症基因（MCP-1、TNF-α、IL-1β和iNOS）表达水平；ASO敲低CCL3-AS1后显著下调MCP-1和iNOS基因表达水平。由于巨噬细胞可分泌多种MMP影响斑块胶原含量和稳定性，本研究分别检测了CCL3-AS1对MMP-1、MMP-3和MMP-9表达水平的影响。结果表明CCL3-AS1对MMP-1和MMP-3的mRNA水平无明显影响，过表达CCL3-AS1升高MMP-9 mRNA表达约1.8倍（P=0.002），反之，敲低CCL3-AS1降低34%的MMP-9表达（P=0.001）（图3A）。在蛋白水平上，过表达CCL3-AS1增加MMP-9蛋白表达水平2.2倍左右（P=0.004），敲低CCL3-AS1降低60%的MMP-9蛋白水平（P<0.001）（图3B）。以上结果提示，CCL3-AS1可能通过促进巨噬细胞炎性活动和MMP-9表达介导斑块不稳定。

2.3 CCL3-AS1促进颈动脉斑块不稳定

为了进一步明确体内CCL3-AS1是否促进颈动脉斑块不稳定，建立了小鼠颈动脉不稳定斑块模型，首先对ApoE^-/-小鼠进行右颈动脉串联结扎手术，慢病毒局部浸润过表达CCL3-AS1，该模型可产生类似于人不稳定的、易破裂的颈动脉斑块（图4A）。Masson染色结果显示，对照组（Lv-NC）颈动脉在串联结扎后主要发生中膜增厚的血管重塑特征，而过表达CCL3-AS1则可促进小鼠颈动脉斑块纤维帽破裂，形成管腔闭塞性血栓（图4B）。免疫荧光染色结果显示，过表达CCL3-AS1明显促进了巨噬细胞（F4/80标记）浸润，炎性巨噬细胞（iNOS标记）和凋亡巨噬细胞（cleaved caspase-3标记）比例明显增加，巨噬细胞MMP-9表达增加（图4C）。以上结果表明，CCL3-AS1促进小鼠斑块巨噬细胞浸润和炎性活动，加速斑块不稳定和破裂。

2.4 CCL3-AS1可能通过与hnRNP-K蛋白结合增强MMP-9 mRNA稳定性

以上研究结果显示CCL3-AS1富集在不稳定斑块巨噬细胞中，过表达CCL3-AS1可以显著影响巨噬细胞炎症因子和MMP-9表达水平，促进颈动脉斑块破裂。为了进一步探索CCL3-AS1的作用靶点，基于颈动脉斑块全转录组测序数据，对CCL3-AS1与巨噬细胞炎症因子和MMPs基因进行了共表达分析，结果显示CCL3-AS1与MMP-9 mRNA水平相关性最高（r=0.89，P=0.001）（图5A）。进一步通过RNA稳定性实验发现CCL3-AS1可以延缓MMP-9 mRNA降解，促进其mRNA稳定性（P=0.032）（图5B）。既往研究表明巨噬细胞中MMP-9过度表达会导致斑块纤维帽胶原降解，加速斑块破裂^[13]。由此推测，巨噬细胞中CCL3-AS1可能通过维持MMP-9 mRNA稳定性促进其表达及分泌，从而影响颈动脉斑块稳定性。为了明确巨噬细胞中CCL3-AS1调控MMP-9表达的分子机制，使用catRAPID omics v2.1网站（http://s.tartaglialab.com/page/catrapid_omics2_group）预测与CCL3-AS1相互作用的蛋白。生物信息学预测结果显示，CCL3-AS1可能与hnRNP-K结合，具体表现为hnRNP-K蛋白389-453位氨基酸（KH3结构域）与CCL3-AS1的26-77位碱基片段存在高亲和力（图5C-D）。RIP实验证实CCL3-AS1、hnRNP-K蛋白和MMP-9 mRNA存在相互作用（图5E）。人颈动脉斑块免疫荧光染色和RNA FISH结果表明，CCL3-AS1与hnRNP-K存在共定位（图5F）。以上结果提示，CCL3-AS1可能通过与hnRNP-K蛋白结合增强MMP-9 mRNA稳定性。

3 讨　论

巨噬细胞参与动脉粥样硬化发生发展的各个阶段，通过介导炎症反应和胞外基质重塑影响斑块进展和稳定性^[14-15]，靶向巨噬细胞治疗可以显著减轻斑块负荷以及减少斑块破裂风险^[16-17]。与其他动脉（尤其是股动脉）相比，人类颈动脉的动脉粥样硬化病变具有更高的炎症负荷，巨噬细胞浸润数量显著增加^[18-19]。斑块成分分析显示，栓塞性缺血患者斑块中的巨噬细胞数量以及MMP-9的表达均高于血流动力学性缺血患者，这表明巨噬细胞炎性活动和MMP-9分泌驱动颈动脉斑块不稳定^[20]。

近年来研究发现富集在巨噬细胞中的lncRNA通过影响巨噬细胞炎性活动和分泌表型影响斑块稳定性^[9,21-22]。Zhang等^[23]发现lnc_000048通过KDM1A/MAP2K2/ERK轴促进巨噬细胞炎症反应和泡沫化，诱导胶原纤维降解从而加速小鼠颈动脉斑块破裂。Hung等^[24]发现LINC01272在冠脉易损斑块部位的巨噬细胞中特异性高表达，可通过上调CD36表达促进巨噬细胞脂质摄取以及活性氧产生，进而导致斑块不稳定。巨噬细胞中NEAT1通过抑制miR-128促进氧化低密度脂蛋白诱导的炎症和氧化应激，加速斑块进展^[25]。循环中ANRIL水平与急性心肌梗死发生风险相关，最新的机制研究发现ANRIL可能通过影响胶原合成导致斑块易损性增加^[26]。新近研究发现lncRNA AK023617通过调节巨噬细胞中与免疫相关的GTP酶家族M蛋白的昼夜节律，影响动脉粥样硬化斑块稳定性^[27]；lncRNA SCARNA8抑制巨噬细胞胞葬作用促进斑块不稳定^[22]。此外，循环MIAT、MALAT1和LIPCAR与急性心肌梗死发生风险相关^{[10, 28-29]}；以上研究提示lncRNA与斑块稳定性相关，可能作为预测斑块破裂相关疾病的生物标志物。

本研究发现，在不稳定颈动脉斑块中，CCL3-AS1富集在巨噬细胞胞浆中。在小鼠颈动脉不稳定模型中，过表达CCL3-AS1诱导巨噬细胞炎性活动和MMP-9分泌，促进斑块破裂与血栓形成。体外研究发现，巨噬细胞CCL3-AS1通过与hnRNP-K结合提高MMP-9 mRNA稳定性从而增加MMP-9表达分泌、降解纤维帽胶原和破坏其完整性。本研究发现了一个新的与颈动脉斑块稳定性相关的lncRNA分子CCL3-AS1，并阐明了其影响斑块稳定性的分子机制，为临床预警斑块不稳定相关疾病如脑卒中和冠心病等提供新的理论依据。

巨噬细胞炎症反应和分泌功能是影响斑块稳定性的重要病理特征，本研究使用人颈动脉晚期不稳定斑块样本，揭示了巨噬细胞分泌的MMP-9通过降解胶原破坏纤维帽结构，加速斑块破裂。此外，本研究通过对ApoE^-/-小鼠右颈动脉串联结扎以构建颈动脉不稳定斑块模型，同样发现iNOS标记的炎性巨噬细胞在不稳定斑块的纤维帽处聚集并伴随MMP-9分泌。体外过表达CCL3-AS1特异性促进巨噬细胞MMP-9而非其他MMP分泌，反之，敲低CCL3-AS1抑制巨噬细胞MMP-9分泌和炎性活动。本研究强调了巨噬细胞是决定斑块稳定性的关键细胞，CCL3-AS1是介导巨噬细胞炎性活动和分泌功能从而影响斑块稳定性的关键分子。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的单链RNA，可形成复杂的二级结构，作为诱饵或分子支架，在转录后水平调控多种基因表达。本研究通过生物信息学预测和RIP实验发现CCL3-AS1与hnRNP-K蛋白存在相互作用。hnRNP-K属于hnRNP核蛋白超家族，是一种DNA/RNA结合蛋白，同时存在于多种亚细胞结构中，通过影响mRNA转录、前体mRNA加工、剪接、转运和翻译等途径参与调控细胞周期、细胞凋亡、信号传导等多种生物学过程^[30]。目前hnRNP-K的研究主要集中在肿瘤领域，其在动脉粥样硬化中的作用机制尚不明确^[31]。hnRNP-K主要包括3个K同源结构域（K homology domains，KHs）：KH1、KH2和KH3，其中KH3可作为一个独立结构域与DNA/RNA结合，发挥重要调控作用。研究^[31-32]表明，hnRNP-K可通过结合lncRNA介导其对靶基因的调控功能，如Xist RNA可在hnRNP-K帮助下通过染色体沉默调控基因表达；circ-0075804通过hnRNP-K结合并维持转录因子E2F3 mRNA稳定性；lncRNA-p21通过hnRNP-K与p53结合抑制其效应基因表达。本研究发现在巨噬细胞中CCL3-AS1可能作为分子支架与hnRNP-K结合后提高MMP-9 mRNA稳定性和表达水平。

综上，本研究发现了影响颈动脉斑块稳定性的新lncRNA CCL3-AS1，该分子通过hnRNP-K/MMP-9通路促进巨噬细胞活动性炎症，加速颈动脉斑块不稳定。

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基金资助

湖南省自然科学基金青年基金资助项目(2023JJ41010)