抑制JAK/STAT信号通路对肝癌细胞生物学行为的调控及机制

Regulation of JAK/STAT pathway inhibition on the biological behavior of hepatocellular carcinoma cells and the mechanism

摘要

背景与目的 肝细胞癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均居高不下。Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路在调控细胞增殖、凋亡及免疫应答中发挥重要作用，其持续激活与肝癌的发生发展密切相关。本研究旨在探讨JAK2抑制剂AG490与STAT3通路相关抑制剂雷帕霉素（RPM）对肝癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。 方法 采用人肝癌细胞系HepG2，分为空白对照组、AG490组、RPM组和AG490+RPM组。通过MTT法、划痕实验和流式细胞术分别检测细胞的增殖、迁移和凋亡；利用ELISA和qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、caspase-3、survivin和c-Myc的蛋白及mRNA表达；Western blot检测JAK2、STAT3及其磷酸化水平。 结果 与对照组比较，AG490组、RPM组和AG490+RPM组的肝癌细胞的增殖和迁移能力均被明显抑制，细胞凋亡明显增加，其中AG490+RPM组作用最为明显（均P0.05）。各抑制剂处理组均表现为Bax和caspase-3表达升高，Bcl-2、survivin和c-Myc表达下降，且AG490+RPM组变化幅度最大（均P0.05）。同时，p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值在各抑制剂处理组均明显降低，以AG490+RPM组最低（均P0.05）。 结论 靶向JAK/STAT通路的抑制剂能够显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡，其机制可能与下调p-JAK2和p-STAT3水平、调控相关凋亡和增殖基因表达有关。AG490与RPM联合应用显示出更强的抗肿瘤作用，提示多靶点联合阻断JAK/STAT通路有望成为肝癌治疗的新策略。

Abstract

Background and Aims Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies, with high incidence and mortality. The JAK/STAT signaling pathway plays a crucial role in regulating cell proliferation, apoptosis, and immune responses, and its persistent activation is closely associated with the development of HCC. This study aimed to investigate the effects of the JAK2 inhibitor AG490 and the STAT3-related inhibitor rapamycin (RPM) on the biological behaviors of HCC cells and their underlying molecular mechanisms. Methods Human hepatoma HepG2 cells were divided into four groups: blank control, AG490, RPM, and AG490+RPM. Cell proliferation, migration, and apoptosis were assessed by MTT assay, scratch test, and flow cytometry, respectively. ELISA and qRT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of Bax, Bcl-2, caspase-3, survivin, and c-Myc. A Western blot analysis was performed to examine the expression and phosphorylation levels of JAK2 and STAT3. Results Compared with the blank control group, the AG490, RPM, and AG490+RPM groups showed significantly decreased cell proliferation and migration abilities, as well as increased apoptosis, with the most pronounced effects observed in the AG490+RPM group (all P0.05). Inhibitor-treated groups showed elevated expression of Bax and caspase-3, decreased expression of Bcl-2, survivin, and c-Myc, with the most significant changes in the AG490+RPM group (all P0.05). In addition, the ratios of p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 were significantly reduced in all treated groups, with the lowest levels in the AG490+RPM group (all P0.05). Conclusion Inhibitors targeting the JAK/STAT pathway significantly suppress proliferation and migration, and induce apoptosis in HCC cells, possibly by downregulating p-JAK2 and p-STAT3, as well as modulating genes related to apoptosis and proliferation. The combined use of AG490 and RPM exhibits superior antitumor effects, suggesting that multi-target blockade of the JAK/STAT pathway may represent a promising therapeutic strategy for HCC.

Graphical abstract

关键词

癌,肝细胞 / Janus激酶抑制剂 / 西罗莫司 / 细胞增殖 / 细胞凋亡 / 分子靶向治疗

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均居高不下，对人类健康构成严重威胁^[1-2]。肝癌起病隐匿，早期症状不典型，多数患者确诊时已属中晚期，丧失了手术切除的最佳时机。对于中晚期肝癌，尽管已有放化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种手段，但由于肿瘤异质性强、易产生耐药性，患者的总体预后仍不理想^[3]。因此，深入探索肝癌的发生发展机制，寻找新的有效治疗靶点，对于改善患者预后至关重要。

近年来，肿瘤微环境在肝癌进展中的作用备受关注。肿瘤细胞并非孤立存在，而是与周围的免疫细胞、基质细胞、血管以及多种细胞因子等共同构成一个复杂的生态系统^[4-6]。在这个微环境中，肿瘤细胞通过多种机制，如上调程序性死亡配体1（PD-L1）等免疫检查点分子的表达、分泌转化生长因子β（TGF-β）和白细胞介素10（IL-10）等免疫抑制因子，来抑制T细胞等免疫细胞的杀伤功能，从而实现免疫逃逸^[7-9]。因此，靶向调控肿瘤微环境、逆转免疫抑制状态已成为肝癌治疗的新方向。

Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路是细胞因子信号转导的关键枢纽，在调控细胞增殖、分化、凋亡及免疫应答中扮演核心角色^[10-12]。该通路的经典激活模式为：细胞因子与受体结合，激活JAK激酶，进而磷酸化STAT蛋白；磷酸化的STAT蛋白（p-STAT）形成二聚体并入核，作为转录因子调控下游靶基因的表达。在肝癌中，JAK/STAT通路特别是STAT3的持续性异常激活，已被证实是驱动肿瘤细胞恶性生物学行为的关键因素，它能促进细胞周期进程、抑制细胞凋亡，并与肿瘤的侵袭和转移密切相关^[13-14]。更重要的是，持续激活的JAK/STAT通路是连接肿瘤细胞内信号与肿瘤免疫微环境的关键桥梁。研究表明，激活的STAT3能够上调PD-L1的表达，帮助肿瘤细胞抵抗T细胞的攻击^[15-17]，同时促进血管内皮生长因子（VEGF）等促血管生成因子的分泌，为肿瘤生长提供养分。因此，抑制JAK/STAT通路不仅可能直接杀伤肿瘤细胞，还可能重塑肿瘤免疫微环境，增强机体的抗肿瘤免疫力，具有一定的治疗潜力。

AG490是一种经典的JAK2酪氨酸激酶抑制剂^[18-19]，而雷帕霉素（rapamycin，RPM）则作为mTOR抑制剂，在多种肿瘤研究中被广泛应用^[20-21]，并且越来越多的证据表明mTOR信号通路与JAK/STAT通路之间存在复杂的串扰，抑制mTOR也能间接影响STAT3的活性^[22-23]。然而，目前尚不清楚联合使用JAK2特异性抑制剂AG490与STAT3通路相关抑制剂RPM是否能在肝癌细胞中产生更强的抗肿瘤效果。基于此，本研究旨在通过联合应用AG490和RPM，探讨双重阻断JAK/STAT信号通路对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响，并阐明其潜在的分子调控机制，为开发更有效的肝癌靶向治疗策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

细胞与试剂：人肝癌HepG2细胞（货号：CL-0103）购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。培养液为含10%胎牛血清（Gibco，货号：10099141）、1%青-链霉素（Solarbio，货号：P1400）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）高糖培养基（Gibco，货号：11965092）。JAK2抑制剂AG490（MCE，货号：HY-12003）、STAT3抑制剂RPM（MCE，货号：HY-10219）。DMEM培养基（江苏齐氏生物科技有限公司）；PBS溶液（上海源叶生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，货号：556547）；B淋巴细胞瘤2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和半胱天冬酶3（caspase-3）ELISA试剂盒（上海广锐生物科技有限公司，货号：GR1022、GR1023、GR1025）。TRIzol试剂（Invitrogen，货号：15596026）；逆转录试剂盒和SYBR Green qPCR Mix（Takara，货号：RR047A、RR820A）。RIPA裂解液（Solarbio，货号：R0010）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（Thermo Fisher，货号：23225）。JAK2（Abcam，ab108596，1∶1 000稀释）、STAT3（Abcam，ab68153，1∶1 000稀释）、p-JAK2（CST，#3776，1∶1 000稀释）、p-STAT3（CST，#9145，1∶1 000稀释）及GAPDH（Abcam，ab181602，1∶5 000稀释）一抗。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（Abcam，ab205718，1∶5 000稀释）。

仪器：CKx41型号倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；iMark型号全波长酶标仪（美国BIO-RAD公司）；Micro17型号微量离心机（美国Thermo公司）；9700型号荧光定量PCR仪器（美国ABI公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与处理

显微镜观察HepG2细胞，确保其无其他微生物污染，使用PBS冲洗3次，并用胰酶消化，脱落细胞，并加入少量DMEM培养基，终止胰酶的消化，收集细胞后离心去除上清液，调整细胞数量为5×10⁶/mL，再加入细胞冻存液（0.1 mL DMSO和1 mL胎牛血清），混匀后转移至冻存管，并行梯度预冷，将冻存管最终保存在-80 ℃冻存管中。细胞复苏：将冻存管从-80 ℃中取出来，快速放置在37 ℃水浴箱中，在超净工作台中酒精消毒，并转移至离心管中，加入适量的DMEM培养基离心，离心后去除上清液，加入适量的DMEM培养基，混匀后转移至新培养瓶培育。细胞培养：在5% CO₂和37 ℃培养箱中，次日更换培养基，待细胞长至80%以上，滴加适量胰蛋白酶，1∶3细胞传代，获得实验所用的对数生长期细胞。取对数生长期HepG2细胞，分为4组：(1) 空白对照组（用含等浓度PBS的DMEM培养液处理）；(2) AG490组（用含50 μmol/L AG490的DMEM培养液处理）；(3) RPM组（用含20 nmol/L RPM的DMEM培养液处理）；(4) AG490+RPM组（用含50 μmol/L AG490和20 nmol/L RPM的DMEM培养液处理）。空白对照组作为基础对照，AG490组用于评价JAK2抑制的作用，RPM组用于评价STAT3通路阻断的作用，AG490+RPM组用于探讨双重抑制是否具有协同效应，从而比较不同抑制方式对HepG2细胞生物学行为的差异影响。所有实验均独立重复3次。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖

收集对数期细胞，以6×10³/孔接种于96孔板，贴壁后按分组处理48 h。每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，使其终浓度为0.5 mg/mL，继续培养4 h。吸去培养液，加入150 μL DMSO，摇床震荡10 min。在492 nm波长下测定吸光度（OD）值，计算抑制率，公式为（空白对照吸光度-试验组吸光度）/（空白对照吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.2.3 划痕实验经检测细胞迁徙能力

将5×10⁶/mL HepG2细胞放置6孔板中，待细胞生长至80%后，按照不同实验分组培育，48 h后，使用0.2 mL吸头垂直于细胞，进行划痕，每孔的痕迹大小为20 mm×1 mm，并设置多个复孔，使用PBS缓冲液冲洗划痕区域，冲洗3遍，尽可能去掉刮落细胞，并吸取适量DMEM培养液，倒置显微镜先拍照观察0 h位置，放置在5% CO₂和37 ℃培养箱中，48 h后再用倒置显微镜拍照48 h位置，细胞的愈合率计算公式为（1~48 h面积/0 h面积）×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集对数期生长细胞，接种在6孔板，调整密度为5×10⁴/mL，按照不同实验分组加入培养液，培养24 h后，离心后收集细胞，使用PBS缓冲液洗涤，去除上清液，再加入结合缓冲液悬浮细胞，取出1×10⁵个细胞，分别加入5 μL PI/PE和Annexin V/FIFC溶液，避光振荡15 min，使用流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况。

1.2.5 ELISA法检测细胞Bax、Bcl-2和caspase-3

收集对数生长期细胞，接种在24孔板，各组设置6个复孔，每孔1×10⁵个，按照不同实验分组加入培养液，培养24 h后，离心收集细胞，重悬后使用PBS缓冲液洗涤，离心弃去上清液，沉淀后加入裂解液持续30 min，每隔5 min振荡1次，最后离心15 min，取上清液-20 ℃保存，ELISA法测定各组细胞Bax、Bcl-2和caspase-3。

1.2.6 qRT-PCR法测定细胞Bax和Bcl-2的mRNA表达

收集对数生长期细胞，在6 cm培养皿中，培养细胞贴壁后，密度5×10⁷个/皿，各组设置3个复孔，按照不同实验分组加入培养液，培养24 h后提取各组细胞总RNA，使用TRIzol试剂提取RNA，鉴定纯度在1.8~2.0之间，方可认为RNA提取合格。PCR仪测定Bax和Bcl-2的mRNA，Bax上游引物：5'-GCT ACA GGG TTT CAT CCA GGG T-3'，下游引物：5'-TGT TGT CCA GTT GCC ATC GC-3'；Bcl-2上游引物：5'-CGG GAG ATC GTG ATG AAG TAC-3'，下游引物：5'-CTC AGG CTG GAA GGA GAA GA-3'；survivin上游引物：5'-CAC CGC ATC TCT ACA TTC AA-3'，下游引物：5'-CAC TTT CTT CGC AGT TTC CT-3'；c-Myc上游引物：5'-ATC ACA GCC CTC ACT CAC-3'，下游引物：5'-ACA GAT TCC ACA AGG TGC-3'；GAPDH上游引物：5'-CAA GGA GTA AGA AAC CCT GGA-3'，下游引物：5'-CCC TGT TGT TAT GGG GTC TGG-3'。PCR反应步骤：预变性95 ℃ 1 min；变性95 ℃ 10 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 15 s，循环40次，以2^-△△Ct计算Bax和Bcl-2的mRNA表达。

1.2.7 Western blot法测定细胞JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达

收集对数生长期细胞，接种在6孔板中，各组设置3个复孔，按照不同实验分组加入培养液，培养24 h后，离心收集细胞，使用PBS缓冲液冲洗3次，加入RIPA裂解液，冰浴30 min，离心后取上清液，BCA法测定蛋白浓度，变性后放置–70 ℃保存。蛋白样品在进行凝胶电泳、转模后，使用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入TBST溶液冲洗，加入JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3和GAPDH一抗（1∶1 000），孵育过夜（4 ℃），TBST溶液系膜，然后加入二抗，比例为1∶4 000，室温下孵育1 h，最后用TBST溶液洗涤，采用超敏增强化学发光显像技术，将平板推入凝胶扫描成像系统。根据光强度确定曝光时间。完成成像后，导出并保存图片。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0进行统计分析。所有计量资料经Shapiro-Wilk检验验证其符合正态分布，并经Levene检验验证符合方差齐性。数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 抑制剂对肝癌细胞增殖的影响

MTT实验结果显示，48 h时，与空白对照组比较，AG490组、RPM组和AG490+RPM组的OD₄₉₂值明显降低（均P0.05）；与AG490组和RPM组比较，AG490+RPM组细胞的OD₄₉₂值明显降低（均P0.05）；AG490组细胞的OD₄₉₂值明显低于RPM组（均P0.05）（图1）。

2.2 抑制剂对肝癌细胞迁徙能力的影响

划痕实验结果显示，与空白对照组比较，AG490组、RPM组和AG490+RPM组的愈合率均明显降低（均P0.05）；与AG490组和RPM组比较，AG490+RPM组细胞的愈合率明显降低（均P0.05）；AG490组细胞愈合率明显低于RPM组（均P0.05）（图2）。

2.3 抑制剂对肝癌细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与空白对照组比较，AG490组、RPM组和AG490+RPM组的凋亡率均明显升高（均P0.05）；与AG490组和RPM组比较，AG490+RPM组细胞的凋亡率均明显升高（均P0.05）；AG490组细胞凋亡率明显高于RPM组（P0.05）（图3）。

2.4 抑制剂对凋亡相关蛋白表达的影响

ELISA结果显示，与空白对照组比较，AG490组、RPM组和AG490+RPM组Bax和caspase-3蛋白表达水平均明显升高，Bcl-2蛋白表达水平均明显降低（均P0.05）；与AG490组和RPM组比较，AG490+RPM组细胞中Bax和caspase-3蛋白表达均明显升高，Bcl-2蛋白表达均明显降低（均P0.05）；AG490组细胞中Bax和caspase-3蛋白表达明显高于RPM组，Bcl-2蛋白表达明显低于RPM组（均P0.05）（表1）。

2.5 抑制剂对凋亡相关基因及下游靶基因mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示，与空白对照组比较，AG490组、RPM组和AG490+RPM组的Bax mRNA表达均明显升高，Bcl-2、survivin和c-Myc mRNA表达均明显降低（均P0.05）；与AG490组和RPM组比较，AG490+RPM组细胞中Bax mRNA表达明显升高，Bcl-2、survivin和c-Myc mRNA表达均明显降低（均P0.05）；AG490组细胞中Bax mRNA表达明显高于RPM组，Bcl-2、survivin和c-Myc mRNA表达明显低于RPM组（均P0.05）（图4）。

2.6 抑制剂对JAK/STAT通路蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与空白对照组比较，AG490组、RPM组和AG490+RPM组p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白比值均明显升高（均P0.05）；与AG490组和RPM组比较，AG490+RPM组p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白比值均明显降低（均P0.05）；AG490组细胞的p-JAK2/JAK2蛋白比值明显低于RPM组（均P0.05），而AG490组细胞的p-STAT3/STAT3蛋白比值明显高于RPM组（均P0.05）（图5）。

3 讨　论

HCC的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，其中信号通路的异常激活扮演了关键角色。JAK/STAT信号通路作为细胞内重要的信号转导轴，其持续激活已被证实是多种恶性肿瘤，包括肝癌在内的共同特征^[24-25]。本研究通过体外实验证实，使用JAK2抑制剂AG490和STAT3通路相关抑制剂RPM均能有效抑制HepG2细胞的迁移与增殖，并显著诱导其凋亡。重要的是，两种抑制剂联合应用时，其抗肿瘤效果较单一用药更为显著，表现出协同增效的作用。这一结论表明，在上下游不同节点同时阻断JAK/STAT信号通路，可能是比单靶点干预更为有效的肝癌治疗策略。

本研究发现与领域内其他研究结果高度一致。例如，多种天然产物或小分子化合物，如雷公藤甲素、千金藤碱和黑豆皮中的花青素等，均被报道可以通过抑制JAK/STAT通路的活性来抑制肝癌细胞的生长并诱导其凋亡^[26-29]。这些研究与本实验结果印证了JAK/STAT通路作为肝癌治疗靶点的重要性和可行性。本研究结果显示，AG490和RPM处理后，肝癌细胞中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平均显著下降，证实了药物确实有效地阻断了该信号通路的活化。磷酸化是JAK和STAT蛋白活化的关键步骤，p-JAK2的减少直接导致其下游底物STAT3的磷酸化水平降低，从而抑制了整个信号通路的级联反应。

为进一步探究其分子机制，本研究检测了细胞凋亡及通路下游相关基因的表达。结果显示，抑制剂处理显著上调了促凋亡基因Bax的表达，同时下调了抗凋亡基因Bcl-2的表达，导致Bax/Bcl-2比值升高，从而激活了下游的执行者caspase-3，最终启动细胞凋亡程序。此外，本研究还观察到STAT3的两个关键下游靶基因survivin和c-Myc的mRNA表达显著下调。survivin是凋亡抑制蛋白家族成员，能直接抑制caspase活性；而c-Myc则是著名的原癌基因，在调控细胞周期和增殖中起核心作用。STAT3作为转录因子，能够直接启动survivin和c-Myc的转录^[30]。由此可见，JAK2/STAT3抑制剂的作用机制为：通过下调JAK2/STAT3磷酸化，调控c-Myc和survivin等下游基因的表达，并改变Bax/Bcl-2的平衡，最终有效抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡。

本研究还评估了联合用药的优势。本研究发现AG490与RPM的联合应用在各项指标上均优于单一用药。其潜在原因可能在于：首先，从信号通路的垂直层面来看，同时抑制上游的激酶JAK2和下游的核心转录因子STAT3，能够更彻底、更全面地阻断信号流，避免了单一靶点抑制后可能出现的代偿性激活或旁路激活。其次，尽管本研究将RPM作为STAT3通路的抑制剂，但其作为mTOR抑制剂的经典功能也不容忽视。mTOR通路与JAK/STAT通路之间存在复杂的相互调控网络^[31-32]。因此，AG490和RPM的联合可能同时抑制了两个对肝癌细胞生存至关重要的核心通路，从而产生了协同抗肿瘤效应。这种联合策略不仅有望提高疗效，还可能通过降低单一药物的使用剂量来减轻潜在的毒副作用，为临床转化提供了新思路。

尽管本研究取得了一些有意义的发现，但仍存在一些局限性。首先，本研究仅限于体外细胞实验，所得结论尚未在动物模型中得到验证。此外，本研究使用了小分子抑制剂，其可能存在脱靶效应，未来需要采用siRNA或shRNA等基因敲低技术进行验证，以更精确地阐明JAK/STAT通路的作用。其次，本研究主要关注抑制剂对肿瘤细胞本身的直接影响，而未深入探讨其对肿瘤免疫微环境的调控作用，例如是否会影响肿瘤细胞PD-L1的表达以及与T细胞等免疫细胞的相互作用^[33]，这也是JAK/STAT通路研究的热点方向。

综上所述，本研究证实了靶向JAK/STAT信号通路的抑制剂AG490和RPM能够有效抑制肝癌细胞的增殖和迁移，促进其凋亡，其机制与抑制JAK2/STAT3磷酸化活化并调控下游凋亡及增殖相关基因的表达密切相关。两种抑制剂的联合应用显示出更优的抗肿瘤活性，提示多靶点协同阻断JAK/STAT通路是肝癌治疗领域一个极具潜力的发展方向。

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