不同基因变异型与BRAF^V600E突变型甲状腺乳头状癌淋巴结转移特征比较

Comparison of lymph node metastatic characteristics between papillary thyroid carcinomas with different genetic alterations and those with BRAF^V600E mutation

摘要

背景与目的：BRAF^V600E突变是甲状腺乳头状癌（PTC）中最常见的基因变异类型，广泛用于指导手术范围及风险评估。然而，其他基因变异在临床中的分布逐渐增多，其与淋巴结转移的关系尚不明确。已有研究大多将BRAF^V600E突变与BRAF野生型进行对比，未对具体突变类型进行分层分析，可能影响判断的准确率。本研究旨在比较不同常见基因变异类型PTC与BRAF^V600E突变型PTC患者的淋巴结转移特征差异。方法：回顾性纳入2019年1月—2025年1月复旦大学附属肿瘤医院接受手术并完成基因检测的4 795例PTC患者，筛选具有单一基因变异的病例并分组。采用倾向性评分匹配（PSM）控制年龄、性别及T分期等混杂因素后，分别比较各突变组与BRAF^V600E突变组的淋巴结转移数目及N分期。结果：PSM后，CCDC6-RET融合组与NCOA4-RET融合组患者的淋巴结转移数目及N1b分期比例明显高于BRAF^V600E突变组（均P<0.05）。ETV6-NTRK3融合组及RAS突变组在淋巴结转移数目和N分期与BRAF^V600E突变组差异无统计学意义（均P>0.05）。结论：CCDC6-RET及NCOA4-RET融合型PTC患者的淋巴结转移负荷显著高于BRAF^V600E突变型，提示其侵袭性更强；而ETV6-NTRK3融合型和RAS突变型与BRAF^V600E突变型相似。术前基因分型有助于识别高转移风险患者，为制定个体化淋巴结清扫方案提供依据。

Abstract

Background and Aims The BRAF^V600E mutation is the most common genetic alteration in papillary thyroid carcinoma (PTC) and is widely used to guide surgical extent and risk stratification. However, other genetic variants are increasingly identified in clinical practice, and their association with lymph node metastasis (LNM) remains unclear. Most existing studies have compared BRAF^V600E-mutated cases with BRAF wild-type cases without stratifying specific mutation types, potentially affecting the accuracy of risk assessment. This study aimed to compare the lymph node metastatic features between PTC patients with different common genetic alterations and those with the BRAF^V600E mutation. Methods A retrospective analysis was conducted on 4 795 PTC patients who underwent surgery and genetic testing at Fudan University Shanghai Cancer Center from January 2019 to January 2025. Patients with a single genetic alteration were included and grouped accordingly. Propensity score matching (PSM) was used to control for confounding factors including age, sex, and T stage. The number of metastatic lymph nodes and N stage were compared between each mutation group and the BRAF^V600E group. Results After PSM, patients in the CCDC6-RET and NCOA4-RET fusion groups had significantly higher numbers of metastatic lymph nodes and N1b stage rates compared to the BRAF^V600E group (all P<0.05). No significant differences were observed between the ETV6-NTRK3 fusion or RAS mutation groups and the BRAF^V600E group in terms of lymph node metastasis or N stage (all P>0.05). Conclusion PTC patients harboring CCDC6-RET or NCOA4-RET fusions exhibit a significantly higher lymph node metastatic burden than those with the BRAF^V600E mutation, suggesting more aggressive behavior. In contrast, ETV6-NTRK3 and RAS-mutated PTCs show similar metastatic profiles to BRAF^V600E-mutated cases. Preoperative genetic profiling may help identify patients at high risk of metastasis and guide individualized lymph node dissection strategies.

关键词

甲状腺肿瘤 / 癌,乳头状 / 淋巴转移 / 基因检测 / 倾向性评分

Key words

Thyroid neoplasms / Carcinoma, Papillary / Lymphatic Metastasis / Genetic Testing / Propensity Score

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，约占所有癌症的2.1%^[1]。最近几十年其发病率以每年6.26%以上的速度不断上升，甲状腺癌相关病死率也以每年0.82%的速度在上升，超过其他已知的任何癌症^[2]。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid cancer，PTC）是甲状腺癌中最常见的病理类型，是一种以淋巴结转移为主要转移途径的恶性肿瘤，研究^[3-4]表明，即使是肿瘤直径<1 cm且临床影像学未提示淋巴结转移的PTC患者中，中央区淋巴结转移率仍可达18.3%~50%。对于微小PTC是否需要进行预防性的淋巴结清扫仍存在争议。BRAF^V600E突变是PTC中最常见的基因变异类型，可用于指导手术范围及风险评估。然而，其他基因变异在临床中的分布逐渐增多，其与淋巴结转移的关系尚不明确。因此，本研究通过倾向性评分匹配（propensity score matching，PSM）分析不同常见基因变异类型PTC与BRAF^V600E突变型PTC患者的淋巴结转移特征差异，旨在为PTC淋巴结清扫范围提供新的治疗决策依据。

1 资料与方法

1.1 临床数据采集

本研究回顾性收集2019年1月2日—2025年1月23日复旦大学附属肿瘤医院头颈外科进行手术治疗的初诊PTC患者，纳入标准：⑴ 所有患者均接受至少一侧甲状腺腺叶切除术或全甲状腺切除术，至少患侧中央区淋巴结清扫术，临床检查提示侧颈可疑转移淋巴结的患者加做侧颈淋巴结清扫术，清扫范围至少为Ⅱ~Ⅳ区淋巴结；⑵ 有完整的病史记录、病理诊断报告（包括颈部淋巴结分区及各区清扫淋巴结数目，转移淋巴结数目）；⑶ 有完整的多基因检测报告。排除标准：⑴ 合并甲状腺滤泡状癌、甲状腺髓样癌、甲状腺低分化癌或甲状腺未分化癌的PTC患者；⑵ 合并远处转移的PTC患者；⑶ 合并其他恶性肿瘤病史的患者；⑷ 临床病理资料不全的患者。本研究收集相关信息获得复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会的批准同意（伦理批号：2201249-3）。

1.2 基因检测

1.2.1 标本采集

本研究患者进行基因检测的样本主要来源于细针穿刺样本、石蜡病理组织及手术新鲜组织。细针穿刺样本要求≥1针，保存于专用的RNA/DNA组织保存液中，冰袋（2~8 ℃）运输，石蜡病理组织要求“白片”连续10~15张，厚度5~10 μm，肿瘤细胞含量>20%，保存期不超过1年，室温（10~30 ℃）运输；手术新鲜组织要求绿豆大小（约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）瘤体组织1块，切取后立即保存在RNA/DNA组织保存液中冰袋（2~8 ℃）运输。

1.2.2 基因检测

石蜡组织标本采用QIAamp DNA FFPE Kit提取肿瘤组织DNA，细胞学标本和新鲜组织采用之江生物的MTG01核酸提取DNA。基因检测采用睿璟生物人甲状腺癌基因检测试剂盒NGS28，其检出变异的符合率99.5%，敏感度99.4%，特异度100%。具体过程为：KAPA HyperPrep Kit构建DNA文库，探针杂交捕获目标区域（覆盖基因编码区±10 bp）；Illumina NovaSeq 6000平台（PE150）测序，平均测序深度≥1 000×，Q30≥85%；FastQC质控，BWA比对人类参考基因组（hg19）；GATK检测SNV/InDel，CNVkit分析拷贝数变异，FusionCatcher识别基因融合；随机抽取部分样本进行复测。

1.2.3 基因检测范围

睿璟生物人甲状腺癌基因检测试剂盒NGS28纳入了甲状腺结节良恶性鉴别中最具特征性、发生率最高的基因变异，可检测的突变形式包括单核苷酸突变/插入或缺失突变（SNV/InDel）、基因融合（fusion）、启动子突变（promoter）。SNV/Indel包括：ALK，RET，AKT1，ATM，BRAF，CHEK2，CTNNB1，EIF1AX，EZH1，FGFR1，FLT3，GNAS，HRAS，KIT，KRAS，NRAS，PIK3CA，PTEN，SPOP，TP53，TSHR，ZNF148。fusion包括：ALK，RET，NTRK1，NTRK3，PAX8，PPARG，ROS1。其中可检测的RET融合共有7种，分别为：CCDC6（E1）-RET（E12）、CCDC6（E8）-RET（E12）、ERC1（E13）-RET（E12）、CCDC6（E8）-RET（E11）、NCOA4（E8）-RET（E12）、SQSTM1（E6）-RET（E11）、CCDC6（E2）-RET（E12）。promoter包括：TERT。

1.3 基因变异分组

为排除多基因变异的影响，选取检测结果中仅有单一基因变异的病例，其中发生频率最高的依次为BRAF^V600E突变、CCDC6-RET融合、ETV6-NTRK3融合、NCOA4-RET融合、RAS突变，将其分为五组，其中BRAF^V600E突变组均为BRAF（NM_004333.4）第15外显子错义突变c.1799T>A（p.Val600Glu）；CCDC6-RET融合组包括CCDC6-RET（NM_005436.5，NM_020975.6）第exon1_exon12外显子融合，CCDC6-RET（NM_005436.5，NM_020975.6）第exon8_exon12外显子融合，CCDC6-RET（NM_005436.5，NM_020975.6）第exon2_exon12外显子融合；NCOA4-RET融合组均为NCOA4-RET（NM_001145261.1，NM_020975.6）第exon8_exon12外显子发生融合；ETV6-NTRK3融合组均为ETV6-NTRK3（NM_001987.5，NM_002530.4）第exon4_exon14外显子发生融合；RAS突变组包括NRAS（NM_002524.4）第3外显子错义突变c.182A>T（p.Gln61Leu），NRAS（NM_002524.4）第3外显子错义突变c.181C>A（p.Gln61Lys），HRAS（NM_001130442.2）第3外显子错义突变c.182A>G（p.Gln61Arg），HRAS（NM_001130442.2）第3外显子错义突变c.181C>A（p.Gln61Lys），KRAS（NM_033360.3）第2外显子错义突变c.35G>A（p.Gly12Asp），KRAS（NM_033360.3）第3外显子错义突变c.182-183delinsGC（p.Gln61Arg），KRAS（NM_033360.3）第3外显子错义突变c.181C>A（p.Gln61Lys）。

1.4 PSM

应用SPSSAU网站（https://spssau.com/indexs.html）进行PSM处理，主变量选取基因变异类型，协变量选取年龄、性别、T分期，分别将CCDC6-RET融合组，NCOA4-RET融合组，ETV6-NTRK3融合组，RAS突变组一一与BRAF^V600E突变组进行PSM，PSM采用最近邻法（卡钳值=0.02），标准化偏差<20%认为匹配成功，检验水准α=0.05，PSM分组后再进行进一步的统计分析。

1.5 统计学处理

采用SPSSAU在线平台（https://spssau.com）进行统计分析。计数资料用例（百分比）[n（%）]表示，组间比较采用χ²检验；符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用t检验，Ⅰ类错误采用Bonferroni校正。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 PSM前患者基线资料

根据基因检测结果将患者分为BRAF^V600E突变组（n=4 331）、CCDC6-RET融合组（n=254）、NCOA4-RET融合组（n=52）、ETV6-NTRK3融合组（n=91）、RAS突变组（n=67）。PSM前，与BRAF^V600E突变组比较，各组基线资料存在明显差异，具体为：BRAF^V600E突变组与CCDC6-RET融合组在性别、T分期、N分期、淋巴结转移数目方面差异有统计学意义（均P<0.05）；与NCOA4-RET融合组在T分期、N分期、淋巴结转移数目方面差异有统计学意义（均P<0.05）；与ETV6-NTRK3融合组在年龄、性别、T分期、N分期方面差异有统计学意义（均P<0.05）；与RAS突变组在T分期、N分期方面差异有统计学意义（均P<0.05）（表1）。

2.2 CCDC6-RET融合组与BRAF^V600E突变组临床病理特征比较

成功匹配254对CCDC6-RET融合组和BRAF^V600E突变组患者，PSM前研究对象的年龄、性别、T分期的标准化偏差分别为11.97%、29.64%、41.65%，PSM后分别为2.06%、3.02%、1.49%，下降幅度明显且标准化偏差绝对值均<20%，匹配效果较好。PSM后两组患者的年龄、性别、肿瘤是否多灶、是否累及被膜，T分期的差异均无统计学意义（均P>0.05），N分期差异仍具有统计学意义（P<0.05）。PSM后CCDC6-RET融合组的淋巴结转移数目仍高于BRAF^V600E突变组[（4.20±5.41）枚vs.（2.98±4.96）枚，t=-2.642，P<0.05]（表2）。

2.3 NCOA4-RET融合组与BRAF^V600E突变组临床病理特征比较

成功匹配52对NCOA4-RET融合组和BRAF^V600E突变组患者，PSM前研究对象的年龄、性别、T分期的标准化偏差分别为12.66%、1.22%、51.99%，PSM后分别为17.11%、16.88%、4.40%，T分期标准化偏差下降幅度明显且各协变量标准化偏差绝对值均<20%，匹配效果较好。PSM后两组患者的年龄、性别、肿瘤是否多灶、是否累及被膜，T分期的差异均无统计学意义（均P>0.05），N分期仍具有统计学意义（P<0.05）。PSM后NCOA4-RET融合组的淋巴结转移数目仍高于BRAF^V600E突变组[（6.75±6.76）枚vs.（2.56±4.22）枚，t=-3.528，P<0.05]（表3）。

2.4 ETV6-NTRK3融合组与BRAF^V600E突变组临床病理特征比较

成功匹配91对ETV6-NTRK3融合组和BRAF^V600E突变组患者，PSM前研究对象的年龄、性别、T分期的标准化偏差分别为27.62%、36.99%、56%，PSM后分别为2.96%、0%、1.41%，各协变量标准化偏差下降明显且PSM后绝对值均<20%，匹配效果较好。PSM后两组患者所有临床病理特征均无统计学意义（均P>0.05）。PSM后ETV6-NTRK3融合组的淋巴结转移数目与BRAF^V600E突变组差异无统计学意义[（3.59±5.30）枚vs.（3.57±4.97）枚，t=-0.029，P>0.05]（表4）。

2.5 RAS突变组与BRAF^V600E突变组临床病理特征比较

成功匹配67对RAS突变组和BRAF^V600E突变组患者，PSM前研究对象的年龄、性别、T分期的标准化偏差分别为25.55%、33.95%、14.78%，PSM后分别为3.69%、4.86%、4.2%，各协变量标准化偏差下降明显且PSM后绝对值均小于20%，匹配效果较好。PSM后两组患者所有临床病理特征均无统计学意义（均P>0.05）。PSM后RAS突变组的淋巴结转移数目与BRAF^V600E突变组差异无统计学意义[（1.22±2.88）枚vs.（1.57±3.21）枚，t=0.652，P>0.05]（表5）。

3 讨　论

虽然PTC总体治疗效果较好，但仍有部分患者预后较差，其恶性程度存在明显的异质性，因此，在手术前对肿瘤的恶性程度进行准确的评估，确定适合患者的手术范围至关重要，既往研究表明年龄、性别、肿瘤最大直径、肿瘤多灶性、肿瘤被膜侵犯以及基因变异类型均可能影响淋巴结转移风险^[5-10]。PTC常见的基因变异事件如BRAF^V600E突变、RAS突变、CCDC6-RET融合等均可对肿瘤的生物学行为产生不同的影响。基因检测技术在近几年发展迅猛，通过细针穿刺标本获得的少量组织即可以进行多个常见基因变异事件的检测，有助于在手术前对肿瘤的转移倾向进行预判，但不同基因变异类型肿瘤转移发生的频率存在较大差异，对比研究中其他混杂因素可能影响比较结果。PSM是一种用于消除非处理因素偏差的统计方法，它通过匹配处理组和控制组的特征，使得两组在干扰因素上的分布尽可能相似，从而更准确地评估处理因素的效果。本研究通过PSM法首次对比了CCDC6-RET融合、NCOA4-RET融合、ETV6-NTRK3融合以及RAS突变与BRAF^V600E单基因突变之间的PTC淋巴结转移差异，发现CCDC6-RET融合组与NCOA4-RET融合组患者的淋巴结转移负荷明显高于BRAF^V600E突变组，且经年龄、性别、T分期PSM后差异仍有统计学意义。然而，与BRAF^V600E突变组相比，RAS突变组和ETV6-NTRK3融合组淋巴结转移负荷较轻，N分期差异有统计学意义，但经PSM后差异无统计学意义，提示单纯依据基因变异类型判断转移风险可能存在偏差，需结合T分期等临床参数综合评估。

BRAF基因是原癌基因，位于染色体7q34上编码B-RAF的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK信号级联反应的细胞内效应子，BRAF^V600E（c.1799T>A）是成人PTC中最常见的基因突变，占所有BRAF突变的95%以上，BRAF^V600E突变提示PTC临床预后较差，其与淋巴结转移的关系备受关注^[11]。临床研究表明，BRAF^V600E突变阳性患者的淋巴结转移发生率显著增高，Xing等^[12]多中心研究显示，在2 156例PTC患者中，BRAF^V600E突变组的淋巴结转移风险较野生型组增加1.89倍（95% CI=1.56~2.29）。然而，此后的一些研究^[13-16]又对这一结果提出异议，其原因有可能是由于BRAF^V600E突变野生组的内部构成较复杂，基因变异类型的构成比不同，甚至是多基因变异的存在，使得不同中心的研究结果存在明显的差异，因此，有必要将不同的基因变异类型与BRAF^V600E突变进行一一比对，随着多基因检测试剂盒的广泛应用，越来越多的临床数据可支持这一研究方法。

RET基因属于原癌基因，编码细胞膜受体酪氨酸激酶，RET与某些基因融合会激活RET，进而激活MAPK和PI3K/AKT信号通路。目前研究显示RET相关的融合基因有10种以上，其中RET/PTC1（CCDC6-RET）和RET/PTC3（NCOA4-RET）最常见，约占80%，无放射史病例检出率约20%，有放射史病例检出率约50%~80%，CCDC6-RET与高分化有关，多见于经典型PTC中，NCOA4-RET与肿瘤的侵袭性相关，多见于实体型或高细胞型的PTC，这两种RET融合的PTC患者一般发病年龄比较年轻、与辐射暴露相关、发病时临床分期较早，且与中央淋巴结转移、颈侧区淋巴结转移、甲状腺外侵犯、远处转移、复发密切相关^[17]。在Bulanova Pekova等^[18]的研究中，993例患者中113例（11.4%）存在RET融合，儿童及青少年患者中发生率（29.8%）是成人（8.7%）的3倍以上。RET融合基因相对于NTRK融合、BRAF^V600E、RAS突变等基因变异展现出更具侵袭性的生物学行为，拥有更高的淋巴结转移率（75.2%）和远处转移率（18.6%）。本研究结果提示CCDC6-RET与NCOA4-RET融合患者的淋巴结转移负荷显著高于BRAF^V600E突变组（P<0.05），且经年龄，性别，T分期PSM后仍具有统计学差异，与之前的研究结果吻合。

NTRK基因编码称为TrkA（NTRK1编码），TrkB（NTRK2编码）或TrkC（NTRK3编码）的原肌球蛋白相关激酶（Trk）家族。一旦结合，NTRK1或者NTRK3就会自动磷酸化，并激活RAS和PI3K等几种靶蛋白的结合位点，从而激活MAPK/RAS/ERK和PI3K/AKT信号传导级联，控制细胞周期的进程、增殖、凋亡和存活^[19]。NTRK的融合有多种，例如ETV6/NTRK3、EML4/NTRK3、RBPMS/NTRK3、SQSTM1/NTRK3、TPM3/NTRK1、IRF2BP2/NTRK1、SQSTM1/NTRK1等，其中ETV6/NTRK3融合在成人PTC中的发生率较高，仅次于RET/PTC融合，约为1%左右，在有辐射史的患者中ETV6-NTRK3的发生率在15%左右，NTRK3的融合相较于NTRK1的融合侵袭性更弱^[20]。本研究结果提示ETV6-NTRK3融合组相较BRAF^V600E突变组淋巴结转移负荷较高，且N分期有统计学差异（P<0.05），但在年龄，性别，T分期PSM后差异无统计学意义。

RAS基因与人类肿瘤密切相关的基因成员有N-RAS、H-RAS和K-RAS，分别定位在1、11和12号染色体上。编码位于细胞膜内表面的G蛋白，后者将信号从受体酪氨酸激酶（RTK）传递到RAS调控的途径。RAS基因中点突变是最常见的突变RAS蛋白的组成性激活，从而激活了其调节的下游信号传导途径，这是甲状腺肿瘤发生的关键信号通路，RAS在PTC中发生频率可达10%~20%，并以N-RAS基因出现的频率更高^[21]。在PTC中，所有含RAS突变的肿瘤会形成肿瘤性滤泡并且没有乳头状结构，因此被诊断为滤泡变异亚型的PTC，在对RAS突变和PTC的侵袭性相关性研究中发现RAS突变与远处转移和高病死率相关^[22]。本研究结果提示RAS突变组相较BRAF^V600E突变组淋巴结转移负荷较轻，且N分期差异有统计学意义（P<0.05），但在年龄、性别、T分期PSM后差异无统计学意义。

由于大量的研究表明BRAF^V600E与侵袭性生物学行为和不良预后有关，一些研究建议对于这些患者可能获益于预防性的淋巴结清扫^[23-24]。Yip等^[25]比较了106例BRAF^V600E突变的患者与同时期的100例BRAF野生型的患者，所有患者均未进行预防性淋巴结清扫术，术后11例突变患者因复发/持续性疾病接受了二次手术，野生型患者中仅3例发生此情况。另一方面，Barbaro等^[26]对110例患者进行术前穿刺检查检测BRAF^V600E突变，并对所有患者进行全甲状腺切除术及预防性中央区淋巴结清扫术，术后病理提示BRAF^V600E并不是淋巴结转移的独立危险因素。有学者^[27-28]认为是否进行预防性的中央区淋巴结清扫需要结合BRAF^V600E突变，临床病理特征如患者年龄、肿瘤是否多灶、是否有包膜外侵犯等综合考虑。但笔者认为，此前研究结果出现争议的主要原因是对于BRAF^V600E野生型的患者没有进行详细区分，虽然TCGA也曾将PTC的基因分为BRAF-like和RAS-like两类，但只是从差异表达基因的改变上有明显差别，具体的临床表现仍缺乏数据支持^[29-30]。BRAF^V600E野生型的患者中可以是如CCDC6-RET，NCOA4-RET等淋巴结转移负荷高于BRAF^V600E的基因变异类型，也可以是RAS突变，ETV6-NTRK3等淋巴结转移负荷低于或近似于BRAF^V600E的基因变异类型。此外，一些发生频率不高的基因变异类型如TERT启动子突变，TP53突变，ALK融合等单基因变异，甚至是同时发生的多基因变异事件，都没有研究进行一一比对，本研究在这一方面仍有不足，今后在进一步积累临床病例的基础上需要进行更加详细地分析，完善患者的长期随访资料。

本研究中CCDC6-RET、NCOA4-RET、ETV6-NTRK3、RAS突变各组样本量相对较小，尤其是RAS突变组，包含3种RAS突变，具有一定的局限性，可能因样本量不足导致假阴性。另外，组间多次比较容易产生Ⅰ类错误，如采用Bonferroni法校正，本研究中四个组分别与对照组比较淋巴结转移数目和N分期，共比较8次，严格的参考标准为0.05/8=0.006 25，根据该标准CCDC6-RET融合组与BRAF^V600E突变组N分期仍有差异，NCOA4-RET与BRAF^V600E突变组淋巴结转移数目仍有差异，其余阳性结果不满足该标准，有待进一步的数据夯实结果。

综上所述，在条件匹配的前提下，CCDC6-RET融合，NCOA4-RET融合的PTC患者淋巴结转移负荷高于BRAF^V600E突变患者，RAS突变，ETV6-NTRK3融合的PTC患者淋巴结转移负荷近似于BRAF^V600E突变患者，术前检测基因变异类型有助于淋巴结清扫范围的决策。

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基金资助

科学技术部四大慢病重大专项基金资助项目(2024ZD0525600)

国家自然科学基金资助项目(82473361)

上海市科委重点领域创新计划基金资助项目(22Y21900100)

上海市抗癌协会翱翔计划基金资助项目(SACA-AX202404)