恶性胆道梗阻介入术后胆道感染患者TLR2 mRNA、HDC和CD64表达特征及预测价值

Expression characteristics and predictive value of TLR2 mRNA, HDC, and CD64 for biliary infection after interventional therapy for malignant biliary obstruction

摘要

背景与目的 胆道感染是恶性胆道梗阻介入治疗后的常见并发症之一，但目前缺乏有效的早期预测指标。本研究探讨Toll样受体2（TLR2）mRNA、组氨酸脱羧酶（HDC）及中性粒细胞CD64在恶性胆道梗阻患者数字减影血管造影（DSA）引导胆道支架联合放射性粒子链植入术后胆道感染的表达变化及其预测价值。 方法 回顾性纳入2021年1月—2024年2月河北省邢台市人民医院285例接受DSA引导胆道支架联合放射性粒子链植入术的恶性胆道梗阻患者，根据术后是否发生胆道感染分为感染组（46例）和未感染组（239例）。比较两组基线资料及术前、术后1 d炎症指标［C-反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、白细胞］及TLR2 mRNA、HDC、CD64水平。采用Pearson相关分析，评价其与CRP的相关性，采用多因素Logistic回归分析影响因素，并通过受试者工作特征曲线（ROC）评估其预测价值。另纳入2024年3月—2024年10月50例患者进行前瞻性验证。 结果 感染组糖尿病、胆结石及高位梗阻比例高于未感染组（均P<0.05）。术后1 d感染组CRP、TLR2 mRNA、HDC及CD64水平均高于未感染组（均P<0.05）。TLR2 mRNA、HDC及CD64与CRP水平均呈正相关（r=0.729、0.682、0.755，均P<0.05），并与感染严重程度呈正相关。多因素Logistic回归分析显示，校正糖尿病、胆结石及梗阻类型后，TLR2 mRNA、HDC及CD64仍为术后胆道感染的独立相关因素（均P<0.05）。ROC分析显示三者联合预测术后胆道感染的曲线下面积为0.923，敏感度为89.13%，特异度为84.10%，优于单项指标。前瞻性验证结果显示预测模型与实际结果一致性良好（κ=0.864）。 结论 恶性胆道梗阻患者DSA引导胆道支架联合放射性粒子链植入术后TLR2 mRNA、HDC及CD64水平升高与胆道感染发生相关，三者联合检测具有较高的早期预测价值，可为术后胆道感染的早期识别提供参考。

Abstract

Background and Aims Biliary tract infection is a common complication after interventional treatment for malignant biliary obstruction (MBO), yet reliable early predictive markers are lacking. This study aimed to investigate the expression of Toll-like receptor 2 (TLR2) mRNA, histidine decarboxylase (HDC), and neutrophil CD64 and evaluate their predictive value for postoperative biliary infection after DSA-guided biliary stent combined with radioactive seed chain implantation. Methods A retrospective cohort of 285 patients with MBO who underwent DSA-guided biliary stent combined with radioactive seed chain implantation between January 2021 and February 2024 was analyzed. Patients were divided into an infection group (n=46) and a non-infection group (n=239) according to the occurrence of postoperative biliary infection. Baseline characteristics, inflammatory markers (CRP, PCT, and white blood cells), and the expression levels of TLR2 mRNA, HDC, and CD64 before surgery and on postoperative day 1 were compared. Pearson correlation analysis was performed to evaluate correlations with CRP levels. Multivariate logistic regression was used to identify independent factors associated with postoperative infection. Receiver operating characteristic (ROC) curves were used to assess predictive performance. An additional prospective cohort of 50 patients (March-October 2024) was used for validation. Results The proportions of diabetes, gallstones, and high-level obstruction were significantly higher in the infection group (all P<0.05). On postoperative day 1, levels of CRP, TLR2 mRNA, HDC, and CD64 were significantly higher in the infection group than in the non-infection group (all P<0.05). TLR2 mRNA, HDC, and CD64 levels were positively correlated with CRP (r=0.729, 0.682, and 0.755, respectively; all P<0.05) and infection severity. After adjusting for diabetes, gallstones, and obstruction level, TLR2 mRNA, HDC, and CD64 remained independent factors associated with postoperative biliary infection (all P<0.05). ROC analysis showed that the combined detection of TLR2 mRNA, HDC, and CD64 achieved an AUC of 0.923, with a sensitivity of 89.13% and specificity of 84.10%. Prospective validation demonstrated good agreement between predicted and actual outcomes (κ=0.864). Conclusion Elevated levels of TLR2 mRNA, HDC, and CD64 are associated with postoperative biliary infection in patients with malignant biliary obstruction. Combined detection of these biomarkers may serve as a promising strategy for early prediction of postoperative biliary infection.

Graphical abstract

关键词

胆道疾病 / 胆汁淤积 / 支架 / 手术后并发症 / 胆道感染

Key words

Biliary Tract Diseases / Cholestasis / Stents / Postoperative Complications / Biliary Infection

恶性胆道梗阻是由癌症所致的以黄疸、胆管扩张、腹痛、发热等为主要表现的一种疾病^[1]。当前数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）引导胆道支架+放射性粒子链植入术是治疗恶性胆道梗阻的常用策略，疗效确切，但术后局部并发症发生风险较高^[2-3]。胆道感染作为最常见的、最棘手的局部并发症之一，可导致患者病情急剧恶化，严重威胁患者生命健康，所以早期预测患者术后胆道感染的风险意义重大^[4]。现阶段尚缺乏早期预测恶性胆道梗阻患者DSA引导胆道支架+放射性粒子链植入术后胆道感染的手段，C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）、白细胞等常规炎症指标多用于诊断性质，用于预测则作用有限，故有必要研究新的标志物。Toll样受体2（Toll-like receptors 2，TLR2）mRNA系固有免疫Toll样受体信号通路重要成员，具有免疫防御作用，可早期识别感染的高风险人群^[5]。组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase，HDC）存在于大脑、心肌、肾等多种器官组织，与肠黏膜屏障、脂肪酸代谢等有关，在内镜下逆行胰胆管造影术后胆道感染患者中表达高于未感染患者，是胆道感染的高危因素^[6]。中性粒细胞CD64与感染类疾病的关系是近年来研究的热点之一，其升高可用于感染类疾病的辅助诊断，且新近研究^[7-8]发现，其对细菌感染高度敏感，能够在感染诊断前早期识别潜在的感染患者。本研究探讨恶性胆道梗阻DSA引导胆道支架+放射性粒子链植入术后胆道感染患者TLR2 mRNA、HDC、CD64表达及预测意义，为临床早期识别术后胆道感染的高危人群提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年1月—2024年2月河北省邢台市人民医院收治的285例行DSA引导胆道支架+放射性粒子链植入术的恶性胆道梗阻患者进行回顾性队列研究。纳入标准：恶性胆道梗阻；成人；行DSA引导胆道支架+放射性粒子链植入术；初次治疗；无免疫缺陷疾病；临床资料完整；2周内无抗菌药物应用史。排除标准：伴胆道外感染；严重脏器功能不全；合并痛风、类风湿关节炎、干燥综合征等；术前存在胆道感染。根据术后是否发生胆道感染分为感染组（46例）、未感染组（239例），胆道感染的诊断及严重程度评估参考中华医学会外科学分会胆道外科学组^[9]制定的相关标准，要同时满足以下两类条件：(1) 临床/影像学标准：出现新发发热（>38.0 ℃）或寒战伴腹痛、黄疸加深、脓性胆汁等表现，或影像学显示新发胆管炎/肝脓肿征象；(2) 实验室/病原学标准：胆汁细菌培养阳性（金标准），或出现白细胞计数异常（>10.0×10⁹/L或<4.0×10⁹/L）、PCT≥0.5 ng/mL、CRP显著升高等系统性炎症证据，并根据指南对确诊患者进行严重程度分级（中度、重度），其中中度感染27例，重度感染19例，病原学均为细菌，观察时间为住院期间，全部患者住院时间10~25 d，平均（16.30±2.10）d。另选取2024年3月—2024年10月的50例患者作为验证集进行前瞻性队列验证。本研究获得医院伦理委员会批准（批号：2024〔045〕）。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

DSA下胆道支架+放射性粒子链植入的适应证参考相关指南^[10-11]。经皮肝穿刺肝左叶肝管，置管造影（拜耳Mark 7高压造影注射系统，造影剂：碘佛醇注射液，国药准字H20113430，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号240504DJ）示：肝左右管贯通显影，胆总管上段截断；经皮肝穿刺道置入8 F导管鞘后，在导丝引导下引入6 F造影导管，使用超滑导丝探查胆总管上段，通过狭窄段后，引入造影导管，退管造影示：胆总管中上段重度狭窄，符合胆管癌表现，狭窄段长度约3 cm；通过造影导管引入双导丝后，撤出导管，留置双导丝；通过其中任1根导丝引入8 mm×60 mm裸支架（苏食药监械生产许20010397号，国械注准20173134610，常州新区佳森医用支架器械有限公司，规格：JSND-08060）1枚，通过另1根导丝引入造影导管，均留置于狭窄段；明确狭窄段及支架位置后，将装载好的粒子链通过造影导管预留于狭窄段，释放支架同时退管并通过导丝推出导管内的粒子链，使粒子链留置于支架与狭窄段之间；留置导丝，退出8 F导管鞘，在导丝引导下，引入8.5 F胆道外引流管。固定引流管，局部包扎，外接引流袋，结束治疗。以上操作均由介入经验5年以上介入医生实施。

1.2.2 基线资料收集

自电子病历系统导出两组年龄、性别、体质量指数（bady mass index，BMI）、糖尿病、胆结石、高血压、肿瘤类型、梗阻分型、支架长度、支架直径、围手术期用药史、血红蛋白、血小板、总胆红素、直接胆红素资料至EXCEL表格，并核验数据录入的准确率。

1.2.3 CRP、PCT、白细胞

术前、术后1 d分别采集空腹血5 mL，以免疫比浊法检测血清CRP，以放射免疫学分析法检测血清PCT水平，行血常规检测记录白细胞水平。

1.2.4 TLR2 mRNA、HDC、CD64表达

取术前、术后1 d空腹血标本，以实时荧光定量PCR法检测血清TLR2 mRNA表达，正反向引物分别为5'-AAC TTA CTG GGA AAT CCT TAC-3'、5'-AAA AAT CTC CAG CAG TAA AAT-3'，以β-actin（正向：5'-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3'，反向：5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3'）作为内参基因，检测基因相对表达量=2^-△△Ct，实验均设立无模板对照、阳性对照、校准样本，仅当无模板对照无扩增信号、阳性对照扩增正常且复孔Ct值变异系数（CV）<5%时，该批数据方被采纳；以ELISA法检测血清HDC，标准曲线回归系数（R²）均>0.99，确保定量准确，每板均设置空白孔、零标准品孔和样本复孔，样本复孔间OD值差异要求<15%；取2 mL血标本，磷酸缓冲液调整细胞浓度为2×10⁷/mL，用CD45-PerCP、CD64-PE、CD14-FITC、CD33-APC进行单克隆抗体的标记，室温孵育20 min加入红细胞裂解液，避光再次孵育10 min，以流式细胞仪和FCS Express V3软件获得CD64表达，用CD64指数表示，公式为（PMN CD64 MFI/Lym CD64 MFI）/（Mo CD64 MFI/PMN CD64 MFI），每次实验前使用单阳性和阴性对照样本精确调节光电倍增管（PMT）电压，并使用CompBeads设置多色荧光补偿矩阵，所有样本由同一名经验丰富的技术人员采用相同的标准化设门模板进行分析，确保结果可比性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 27.0软件，计数资料用例数（百分比）[n（%）]表示，行χ²检验，计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，行独立样本t检验；应用Pearson相关性统计法分析术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达与CRP的相关性，采用多因素Logistic回归分析术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达对术后胆道感染的影响，采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析不同方案预测术后胆道感染的价值，不同方案间曲线下面积（area under the curve，AUC）的比较采用DeLong检验；κ值分析TLR2 mRNA+HDC+CD64预测结果与临床实际一致性。检验水准P<0.05。

2 结　果

2.1 患者基线资料

病原学结果显示，革兰氏阳性细菌感染12例，革兰氏阴性细菌感染34例。感染组糖尿病、胆结石、高位梗阻患者占比高于未感染组（均P<0.05）；两组其他基线资料比较无明显差异（均P>0.05）（表1）。

2.2 两组手术前后CRP、PCT、白细胞水平比较

感染组术前CRP、PCT、白细胞水平与未感染组差异无统计学意义（均P>0.05）；两组术后1 d CRP均明显高于术前（均P<0.05），但感染组术后1 d CRP的升高程度大于未感染组（P<0.05）；两组术后1 d的PCT、白细胞水平差异无统计学意义（均P>0.05）（表2）。

2.3 两组手术前后TLR2 mRNA、HDC、CD64表达水平比较

感染组术前TLR2 mRNA、HDC、CD64表达与未感染组比较无明显差异（均P>0.05）；感染组术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达均明显高于术前（均P<0.05）；感染组术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达高于未感染组（P<0.05）；未感染组术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64与术前比较无明显差异（P>0.05）（图1）。不同病原菌感染患者术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达比较无明显差异（P>0.05）（表3）。

2.4 术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达与CRP及感染严重程度的相关性

Pearson相关性分析结果显示，术后1 d TLR2 mRNA（r=0.729）、HDC（r=0.682）、CD64表达（r=0.755）与术后1 d的CRP水平呈正相关（均P<0.05）。术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达与感染严重程度呈正相关（r=0.751、0.784、0.760，均P<0.001）。

2.5 术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达对术后胆道感染的影响

由于术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达与CRP的相关性显著，方差膨胀因子为14，存在多重共线性问题，所以手动将CRP排除。以术后胆道感染发生情况为因变量（未发生=0，发生=1），以糖尿病（无=0，有=1）、胆结石（无=0，有=1）、梗阻分型（低位梗阻=1，高位梗阻=2）、TLR2 mRNA（按实测值赋值）、HDC（按实测值赋值）、CD64（按实测值赋值）为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，糖尿病、胆结石、高位梗阻、TLR2 mRNA、HDC、CD64均是术后胆道感染的相关影响因素（均P<0.05）；将糖尿病、胆结石、高位梗阻进行校正，以术后胆道感染发生情况为因变量（未发生=0，发生=1），以TLR2 mRNA（按实测值赋值）、HDC（按实测值赋值）、CD64（按实测值赋值）为自变量分析显示，校正了糖尿病、胆结石、高位梗阻后，TLR2 mRNA、HDC、CD64仍是术后胆道感染的独立相关影响因素（均P<0.05）（表4）。

2.6 不同方案预测术后胆道感染的价值

ROC分析显示，术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64的ROC下的AUC与CRP相近（Z=0.015、0.019、0.006，均P>0.05）；术后1 d TLR2 mRNA的AUC最大，HDC的敏感度最高，CD64的特异度最高。运用Logistic回归拟合法得到不同联合方案的AUC显示，TLR2 mRNA+HDC+CD64的AUC大于CRP、TLR2 mRNA、HDC、CD64（Z=4.216、3.891、4.017、4.105，P=0.000、0.000、0.000、0.000）；TLR2 mRNA+HDC+CD64的AUC大于TLR2 mRNA+HDC+CRP与HDC+CD64+CRP（Z=2.143、1.899，P=0.032、0.045），TLR2 mRNA+HDC+CD64的AUC与TLR2 mRNA+HDC+CD64+CRP比较无明显差异（Z=1.412，P=0.158）。从检测指标数量、经济学、预测性能综合考虑，TLR2 mRNA+HDC+CD64为最优方案，其预测敏感度为89.13%，特异度为84.10%（图2）（表5）。

2.7 TLR2 mRNA+HDC+CD64的前瞻性队列验证

在验证集中，感染组9例，未感染组41例。采用TLR2 mRNA+HDC+CD64准确预测感染8例，未感染40例。TLR2 mRNA+HDC+CD64预测结果与临床实际一致性分析显示，其κ=0.864（95% CI=0.587~0.997），符合率=96.00%（P<0.05）。

3 讨　论

恶性胆道梗阻DSA引导胆道支架+放射性粒子链植入术后胆道感染的发生与多种因素有关，涉及癌细胞的免疫抑制、手术侵入性操作、放射损伤等，若未及时识别，可快速进展为脓毒症、多器官功能障碍，威胁生命，因此研究能早期识别术后感染的潜在人群至关重要^[12-14]。

本研究发现感染组合并糖尿病、胆结石和高位梗阻的比例更高，其中糖尿病可能通过高血糖介导的免疫细胞功能抑制削弱全身防御；胆结石作为细菌生物膜载体可直接促进局部感染；而高位梗阻则因解剖复杂性和引流不彻底增加操作相关感染风险，因此三者可能从不同维度共同构成了胆道感染的病理生理基础。CRP、PCT、白细胞是目前临床评估感染常用的辅助指标，在感染发生后数小时可明显升高^[15-17]。本研究结果显示，感染组术前CRP、PCT、白细胞与未感染组比较无明显差异，感染组术后1 d CRP高于术前及未感染组，提示PCT、白细胞识别感染潜在人群的作用有限，仅术后早期的CRP与恶性胆道梗阻患者术后胆道感染有关，可能有助于早期预测术后胆道感染的发生。ROC分析显示，术后1 d CRP预测术后胆道感染的AUC为0.813，呈现出一定预测价值。

TLR2 mRNA是固有免疫的主要功能载体，能识别肽聚糖、脂多糖，结合配体后将信号传导至下游，招募关键接头蛋白，进而活化促炎细胞与促炎细胞因子^[18-20]。生理状态下TLR2 mRNA微量表达，组织损伤或机体存在微量细菌内毒素时，TLR2 mRNA即可被激活^[21-23]。研究^[24-25]发现，急性胆道感染可导致肠黏膜屏障损伤，HDC水平升高，且肠黏膜屏障损伤也可通过肠道细菌移位途径，导致胆道感染，故两者具有因果关系。HDC水平升高反映了肠黏膜屏障受损，且水平越高肠黏膜屏障受损越严重^[26-27]。CD64参与机体的体液和细胞免疫，生理状态下基本不表达，细菌感染后可迅速升高，升高程度与感染程度成正比，募集中性粒细胞、巨噬细胞等放大炎症反应^[28-29]。本研究结果显示，感染组术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达高于未感染组，相关性分析显示，术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64表达与CRP水平呈正相关，表明了TLR2 mRNA、HDC、CD64表达在评估机体炎症反应方面的价值。TLR2 mRNA、HDC、CD64表达对术后胆道感染的影响，在校正了糖尿病、胆结石、高位梗阻后，仍是独立相关影响因素，具有作为术后胆道感染预测标志物的潜质。袁殿宝等^[30]的研究纳入了120例经内镜胆道内置管引流术低位恶性梗阻性黄疸患者，根据是否发生术后感染将患者分为两组，发现感染组TLR2 mRNA高于未感染组，TLR2 mRNA可作为术后胆道感染的一个分子标志物，本研究结论与之相似。

在以上研究基础上，本研究还创新性发现，术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64预测术后胆道感染的AUC不劣于传统炎症标志物CRP，且术后1 d TLR2 mRNA+HDC+CD64的AUC为0.923，显著大于CRP，且TLR2 mRNA+HDC+CD64的AUC大于TLR2 mRNA+HDC+CRP与HDC+CD64+CRP，TLR2 mRNA+HDC+CD64的AUC与TLR2 mRNA+HDC+CD64+CRP比较无明显差异，从检测指标数量、经济学、预测性能综合考虑，TLR2 mRNA+HDC+CD64为最优方案，表明联合检测术后1 d TLR2 mRNA、HDC、CD64能提高对术后胆道感染的预测价值，能为临床提供更准确的参考信息，这可能与三者涵盖了更为全面的机体应答感染的机制有关。且术后1 d TLR2 mRNA+HDC+CD64的预测敏感度为89.13%，特异度为84.10%，呈现出较高的预测效能。介入性手术（如经皮肝穿刺、支架置入）本身作为一种创伤，可在术后超早期（如6~12 h内）引发强烈的非特异性应激与炎症反应，而使TLR2 mRNA、HDC、CD64等出现一过性升高，从而干扰对早期细菌感染的特异性识别，故本研究选择术后1 d进行检测，旨在规避手术创伤所致的急性期反应高峰，使机体从初始应激状态进入相对稳定的阶段。此时若TLR2 mRNA、HDC、CD64水平仍持续升高或再度攀升，则更可能反映了特定的病原体识别、黏膜屏障损伤及髓系细胞激活等感染相关病理生理过程，而非单纯的创伤反应，结果证实，在此时间点，这三项指标在感染组与未感染组间已出现显著分化，并展现出优异的预测价值，未来的研究可通过设立术前基线及术后多个连续时间点（如6、12、24、48 h）的动态监测，绘制这些标志物的详细动力学曲线，以更精确地界定其从应激反应向感染信号转变的临界点，从而构建出时相特异性更强、预测窗口更前移的优化模型。目前，胆汁培养是确诊金标准，但其从采样到最终报告通常需要48~72 h，甚至更长，本研究TLR2 mRNA+HDC+CD64方案中，TLR2 mRNA需4~4.5 h，HDC需3~4 h，CD64需1~1.5 h，且血标本采集于术后1 d，术后24 h内即可提供高风险预警，使临床医生能够在感染确诊前即对有风险的患者加强监测、早期留取病原学标本，并更为审慎地评估或启动经验性抗感染治疗，从而为改善预后争取宝贵时间。本研究不足之处在于，样本量较大（285例），但感染组仅46例，可能导致统计效能不足，且为回顾性研究，随访时间短，可能存在选择偏倚，未来仍需通过多中心研究扩大样本量，进行前瞻性研究，以进一步验证研究结果。值得注意的是，TLR2 mRNA检测采用的是荧光定量聚合酶链法，耗时通常需4~4.5 h，下一步仍需研究TLR2 mRNA更为快速、简便的检测方法，提高效率，扩大受益患者群体。

综上所述，恶性胆道梗阻DSA引导胆道支架+放射性粒子链植入术后TLR2 mRNA、HDC、CD64表达与胆道感染有关，在缺乏有效的预测手段时，联合检测三者可作为早期识别术后胆道感染潜在人群的一个预测方案，为临床防治胆道感染提供参考。

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基金资助

河北省邢台市重点研发计划自筹基金资助项目(2020ZC370)