TENT5B上调PRKAA2表达促进胃癌铁死亡的作用与机制研究

The role and mechanism of TENT5B in upregulating PRKAA2 expression to promote ferroptosis in gastric cancer

摘要

背景与目的 胃癌是全球高发且预后不良的恶性肿瘤，现有治疗手段疗效有限。铁死亡作为一种新型细胞死亡方式，在肿瘤治疗中具有重要潜力。末端核苷酸转移酶5B（TENT5B）在多种肿瘤中低表达，但其在胃癌中的作用尚未明确。本研究旨在探讨TENT5B在胃癌中的表达特征及其通过调控铁死亡抑制肿瘤进展的机制。 方法 通过TCGA和GEO数据库分析TENT5B在胃癌中的表达情况，并采用qRT-PCR和Western blot检测其在胃癌组织及细胞中的表达水平；利用CCK-8、克隆形成、划痕愈合和Transwell实验评估TENT5B过表达对胃癌细胞增殖和迁移的影响；通过细胞活力、脂质活性氧化物和丙二醛水平分析铁死亡情况；结合生物信息学、mRNA稳定性检测和功能挽救实验探讨其分子机制；并通过小鼠皮下成瘤实验验证其体内作用。 结果 TENT5B在胃癌组织和细胞中明显下调。过表达TENT5B可抑制胃癌细胞增殖和迁移，并促进铁死亡。机制研究表明，TENT5B通过增强PRKAA2 mRNA稳定性上调其表达，进而介导铁死亡的发生。体内实验进一步证实TENT5B过表达可抑制肿瘤生长并提高PRKAA2水平。 结论 TENT5B作为潜在的抑癌基因，可通过增强PRKAA2 mRNA稳定性促进铁死亡，从而抑制胃癌进展。本研究为胃癌铁死亡靶向治疗提供了新的分子依据和潜在治疗策略。

Abstract

Background and Aims Gastric cancer remains a common malignancy worldwide with a poor prognosis and limited response to current therapies. Ferroptosis, a novel form of regulated cell death, has emerged as a promising therapeutic target in cancer. Terminal nucleotidyltransferase 5B (TENT5B) is downregulated in various tumors, but its role in gastric cancer and ferroptosis remains unclear. This study aimed to investigate the expression pattern and biological function of TENT5B in gastric cancer and to elucidate its underlying mechanisms in regulating ferroptosis. Methods The expression of TENT5B in gastric cancer was analyzed using TCGA and GEO datasets, and further validated in gastric cancer tissues and cell lines by qRT-PCR and Western blotting. CCK-8, colony formation, wound healing, and Transwell assays were performed to evaluate the effects of TENT5B overexpression on cell proliferation and migration. Ferroptosis was assessed by measuring cell viability, lipid ROS, and MDA levels. Bioinformatics analysis, mRNA stability assays, and rescue experiments were conducted to explore the molecular mechanisms. A subcutaneous xenograft mouse model was used to validate the in vivo effects. Results TENT5B was significantly downregulated in gastric cancer tissues and cells. Overexpression of TENT5B inhibited cell proliferation and migration while promoting ferroptosis. Mechanistically, TENT5B enhanced PRKAA2 mRNA stability and upregulated its expression, thereby exerting tumor-suppressive effects. In vivo, TENT5B overexpression suppressed tumor growth and elevated PRKAA2 expression. Conclusion TENT5B functions as a tumor suppressor in gastric cancer by stabilizing PRKAA2 mRNA, promoting ferroptosis, and inhibiting cancer progression. These findings suggest that TENT5B may serve as a promising molecular target for ferroptosis-based therapeutic strategies in gastric cancer.

Graphical abstract

关键词

胃肿瘤 / 铁死亡 / DNA核苷酸外转移酶 / AMP活化蛋白激酶类

Key words

Stomach Neoplasms / Ferroptosis / DNA Nucleotidylexotransferase / AMP-Activated Protein Kinases

胃癌是我国乃至全球最常见的恶性肿瘤之一，但大部分患者对现有治疗手段（如化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗）不敏感，复发转移率高、预后差，导致病死率居高不下^[1-3]。胃癌的防治迫切需要寻找新的靶点，研发新的药物。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新型细胞死亡方式，因其在肿瘤治疗中的潜力而受到国内外广泛关注^[4-7]。末端核苷酸转移酶5B（terminal nucleotidyltransferase 5B，TENT5B），又称为序列相似家族46成员B（FAM46B），是一种重要的poly（A）聚合酶^[8-9]，在多种肿瘤中被发现表达下调，且与肿瘤的发生发展密切相关^[10-13]。然而，TENT5B在胃癌中的作用及其对铁死亡的影响尚不清楚。本研究旨在探究TENT5B对胃癌细胞增殖、迁移和铁死亡的影响及其作用机制，以期为胃癌的精准治疗提供新策略和新方法。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集2024年6月—2024年12月在中南大学湘雅三医院胃肠外科接受手术治疗的25例胃癌患者的癌组织和癌旁正常组织（距癌灶边缘10 cm以上的正常胃黏膜组织）标本，利用液氮速冻后冻存于-80 ℃冰箱。所有患者术前均未接受过化疗、靶向治疗、免疫治疗和放疗等抗肿瘤治疗。本研究通过了中南大学湘雅三医院伦理委员会审批（批号：24308）。

1.2 细胞系和细胞培养

人正常胃上皮细胞株（GES-1）和胃癌细胞株（AGS和HGC27）均购自美国典型菌种保藏中心（ATCC），并在含10%胎牛血清（美国Sigma-Aldrich公司）、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）中培养。上述细胞均置于37 ℃、含5% CO₂的细胞培养箱中培养，定期换液和传代。所有细胞均经过短串联重复序列（STR）鉴定，且没有支原体污染。

1.3 方法

1.3.1 慢病毒转染

TENT5B的过表达慢病毒和阴性对照慢病毒均由上海吉凯基因公司构建。慢病毒细胞转染和药物筛选过程参照吉凯公司提供的操作步骤进行，简述如下：选取处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，根据细胞种类配制病毒感染液，加入各孔；病毒感染细胞12~24 h后，予以换液；细胞培养48~72 h 后，予以嘌呤霉素（浓度为5~10 µg/mL）进行药物筛选，存活的细胞即为稳定转染细胞株；细胞通过qRT-PCR和Western blot检测验证过表达效率后，用于细胞功能实验和分子机制研究。

1.3.2 qRT-PCR检测

使用RNA_fast200总RNA极速抽提试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）提取组织和细胞中的总RNA，再利用NanoDrop™ OneC超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司）测定RNA样品的浓度和纯度。按照Evo M-MLV反转录预混型试剂盒（含去除gDNA试剂）Ver.2（湖南艾科瑞生物公司）的操作步骤将RNA去除gDNA并逆转录为cDNA后，再按照SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物公司）的操作步骤进行qRT-PCR扩增。以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算倍数变化值（FC）。引物序列为：TENT5B正向：CCT GCC TAC TAG ACT TCC TGC，反向：CTT GCC GCT CTT GTT GGA CA；GAPDH正向：AGC CAC ATC GCT CAG ACA C，反向：GCC CAA TAC GAC CAA ATC C。

1.3.3 细胞增殖检测（CCK-8）

将不同处理的胃癌细胞分别接种至96孔板（1 000~3 000个/孔）中培养，每组设置5个复孔。分别于培养0、24、48和72 h，向每孔加入100 μL浓度为10%的CCK-8检测试剂（武汉亚科因生物技术有限公司），于37 ℃培养箱中孵育1 h后，使用多功能酶标仪（美国Bio-Tek Instruments公司）检测450 nm波长处的光密度（OD）值。

1.3.4 平板克隆形成实验

将不同处理的胃癌细胞分别接种至6孔板（200~500个/孔）中培养，每组设置3个复孔。培养7~10 d后弃去培养基，用PBS清洗2遍，然后用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.25%结晶紫染色15 min，清洗干净后室温下自然干燥。拍照并计数各孔中的细胞克隆球数目。

1.3.5 划痕愈合实验

将不同处理的胃癌细胞接种至6孔板（5~8×10⁵个/孔）中，培养过夜。待其融合密度达到90%~100%时，用移液器枪头在细胞表面划痕，保证每条划痕粗细均匀一致。用PBS清洗3次，去除脱落的细胞，加入不含血清的培养基继续培养。分别于0 h和24 h进行拍照，观察划痕愈合的情况。细胞迁移率（也称为伤口愈合率），通过以下公式计算：细胞迁移率（%）=[（0 h细胞间距-24 h细胞间距）/ 0 h细胞间距]×100%。

1.3.6 Transwell迁移实验

将不同处理的胃癌细胞接种至Transwell小室上室（3~5×10⁵个/孔），培养基体积为200 μL，不含血清；下室加入600 μL含有20%胎牛血清的培养基。37 ℃孵育24 h后取出小室，先用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.25%结晶紫染色15 min，最后用棉签轻轻拭去小室内表面细胞。在倒置显微镜（日本Olymbus公司）下观察并计算5个随机视野中的迁移细胞数。

1.3.7 细胞活力检测

采用CellTiter-Glo^® Luminescent Cell Viability Assay试剂盒（美国Promega公司），通过对三磷酸腺苷进行定量来检测细胞活力。将不同处理的胃癌细胞分别接种至96孔板（1~2×10⁴个/孔）中培养，每组设置3个复孔。细胞经处理后，向每孔加入100 μL Cell Viability检测试剂；室温避光孵育10 min后，使用多功能酶标仪（美国Bio-Tek Instruments公司）检测生物发光信号强度。细胞活力的计算公式为：细胞活力（%）=（细胞处理组-空白背景组）/（细胞对照组-空白背景组）×100%。

1.3.8 脂质活性氧化物（ROS）和丙二醛（MDA）检测

参照文献^[14]，采用BODIPY 581/591 C11探针（美国Thermo Scientific公司）检测胃癌细胞中的脂质ROS水平；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）检测胃癌细胞中的MDA（脂质过氧化的终产物）浓度。

1.3.9 mRNA稳定性检测

将不同处理的胃癌细胞接种至6孔板（3~5×10⁵个/孔）中，培养过夜。待其融合密度达到70%左右时，用5 μg/mL的放线菌素D（美国Sigma-Aldrich公司）处理细胞以抑制RNA的生成。在指定的时间点（0、1、2、4、8 h）分别提取细胞总RNA，采用qRT-PCR检测PRKAA2 mRNA的相对剩余量（%），并计算其半衰期。

1.3.10 Western blot实验

使用全蛋白提取试剂盒（江苏凯基KeyGEN生物技术股份有限公司）从组织或细胞中提取全蛋白。将等量的蛋白通过10%的SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上（美国Millipore公司）。用8%脱脂牛奶室温下封闭PVDF膜1 h后，先用特异性一抗在4 ℃孵育过夜，然后用相应的二抗在室温孵育1 h。最后，使用ChemiDoc Touch化学发光成像仪（美国Bio-Rad公司）进行膜显影，并使用Image Lab软件进行图片编辑。本研究使用的抗体均购自武汉三鹰（Proteintech）生物技术有限公司：抗TENT5B抗体（货号：23149-1-AP；1∶1 000稀释）、抗PRKAA2抗体（货号：18167-1-AP；1∶1 000稀释）和抗GAPDH抗体（货号：60004-1-Ig；1∶6 000稀释）。

1.3.11 动物实验

6只雌性NOD-SCID小鼠（5~6周龄、体质量18~20 g）购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，并饲养于中南大学实验动物学部。小鼠置于独立通气笼盒内，SPF级环境，自由摄食高压灭菌饲料和饮水。小鼠适应性喂养1周后，随机分成两组（对照组和过表达组），每组3只。对照组于每只小鼠腋部皮下注射5×10⁶个对照胃癌细胞（重悬于100 μL PBS中），而过表达组注射等量过表达TENT5B的胃癌细胞。每周观察并记录小鼠饮食活动状态、体质量和肿瘤大小，肿瘤体积按公式0.5×长×宽²计算。所有动物实验方案均获中南大学实验动物部伦理委员会批准（批号：XMSB-2024-0220），并遵守国家卫生研究院制定的《实验动物福利和使用指南》。

1.4 统计学处理

使用GraphPad Prism 10.0软件进行数据分析和绘图。本研究中的所有实验（除外动物实验）均进行了至少3次生物学重复，并展示了其中1次代表性实验数据。计量资料采用均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示；癌组织与癌旁组织中TENT5B表达水平的比较采用配对样本t检验，非配对设计两组间均数比较则采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，则采用Dunnett's检验进行多重比较；重复测量数据采用重复测量方差分析。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 TENT5B在胃癌中的表达

TCGA胃癌数据集和GEO胃癌数据集（GSE66229）差异表达基因分析发现，TENT5B在胃癌中的表达明显下调（图1A-B）。通过qRT-PCR和Western blot检测进一步发现，与癌旁正常组织相比，TENT5B在胃癌组织中的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著降低（图1C-D）。qRT-PCR和Western blot结果还显示：TENT5B在2株胃癌细胞系中的mRNA表达水平和蛋白表达水平均低于正常胃上皮细胞系（图1E-F）。这些结果提示：TENT5B在胃癌中异常低表达。

2.2 过表达TENT5B对胃癌细胞的增殖和迁移的影响

qRT-PCR和Western blot检测结果显示：转染TENT5B过表达慢病毒组（过表达组）AGS细胞的TENT5B mRNA和蛋白表达水平均显著高于空载对照组（对照组）（图2A-B），提示在AGS细胞中过表达TENT5B成功。CCK-8实验和平板克隆形成实验显示：与对照组细胞相比，过表达组AGS细胞的增殖能力明显减弱（图2C-E）。划痕愈合实验和Transwell迁移实验还显示：过表达TENT5B后，AGS细胞的迁移能力明显减弱（图2F-I）。这些结果提示：过表达TENT5B可抑制胃癌细胞的增殖和迁移。

2.3 过表达TENT5B对胃癌细胞铁死亡的影响

细胞活力检测结果显示：过表达TENT5B可明显增加铁死亡诱导剂Erastin诱导的AGS细胞死亡，而且该效应可被铁死亡抑制剂（ferrostatin-1，Fer-1）阻断（图3A）。脂质ROS检测结果显示：过表达TENT5B可升高AGS细胞内的脂质ROS水平，并显著增加Erastin诱导的脂质ROS，而且该效应可被Fer-1阻断（图3B）。MDA检测结果也显示：过表达TENT5B可升高AGS细胞内的MDA水平，并显著增加Erastin诱导的MDA产生，而且该效应可被Fer-1阻断（图3C）。这些结果提示：过表达TENT5B可促进胃癌细胞的铁死亡。

2.4 过表达TENT5B对PRKAA2 mRNA稳定性及PRKAA2表达的影响

将TCGA胃癌数据集中与TENT5B表达呈明显正相关（R>0.4，P<0.05）的基因与铁死亡数据库（FerrDb V2）中促进铁死亡的基因取交集后，得到6个重叠基因（图4A）。其中，PRKAA2与TENT5B的表达相关性较高（R=0.46，P<2.2e-16）（图4B），而且PRKAA2在胃癌中的表达也明显下调（图4C）。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，在AGS细胞中过表达TENT5B后，PRKAA2的mRNA和蛋白表达水平均明显上调（图4D-E）。通过mRNA稳定性检测进一步发现，过表达TENT5B后PRKAA2 mRNA的稳定性增加，半衰期明显延长（图4F）。这些结果提示：过表达TENT5B可能通过增加PRKAA2 mRNA稳定性促进PRKAA2的翻译表达。

2.5 功能挽救实验结果

qRT-PCR和Western blot检测结果显示：在过表达TENT5B的AGS细胞中转染si-PRKAA2，可以逆转TENT5B过表达引起的PRKAA2表达上调（图5A-B）。CCK-8实验和Transwell实验显示，敲减PRKAA2可以逆转TENT5B过表达对AGS细胞增殖和迁移的抑制作用（图5C-E）。细胞活力检测和MDA检测结果显示，敲减PRKAA2可以逆转TENT5B过表达对AGS细胞铁死亡的促进作用（图5F-G）。这些结果提示：TENT5B可能通过上调PRKAA2表达，促进胃癌细胞铁死亡，并抑制胃癌进展。

2.6 过表达TENT5B胃癌细胞体内生长的影响

小鼠皮下成瘤实验显示：与对照组比较，过表达组细胞成瘤速率明显减慢、成瘤重量明显减轻（图6A-C）；而且，过表达组瘤组织中TENT5B和PRKAA2的mRNA表达水平均明显高于对照组（图6D）。上述结果提示：过表达TENT5B可能通过上调PRKAA2表达在体内抑制胃癌的生长。

3 讨　论

3.1 TENT5B可能是调控胃癌发生发展的抑癌基因

近年来有多项研究报道，非典型poly（A）聚合酶TENT5B在前列腺癌^[10-11]、非小细胞肺癌^[12]、乳腺癌^[13] 等多种实体瘤中呈低表达，并与肿瘤发生发展和治疗抵抗密切相关^[15]。然而，TENT5B在胃癌中的表达特征和生物学功能研究尚属空白。本研究首次发现TENT5B在胃癌组织和胃癌细胞中均显著下调；而且，过表达TENT5B可显著抑制胃癌细胞的增殖和迁移，提示TENT5B可能是抑制胃癌发生发展的重要因子。这一发现与Liang等^[10-11]在前列腺癌和Sang等^[12]在非小细胞肺癌中的研究报道互为印证。其中，Liang等^[10]发现过表达TENT5B可促进β-catenin蛋白的泛素化降解，进而阻碍前列腺癌细胞增殖和细胞周期进程。他们还发现，TENT5B通过阻断MYC-LDHA轴促进前列腺癌细胞凋亡，并抑制糖酵解^[11]。此外，Sang等^[12]的研究显示：过表达TENT5B可通过阻断β-catenin/MMP7信号轴，抑制非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭。本研究的发现结合这些研究结果提示，TENT5B的抑癌作用可能具有跨瘤种共性。

3.2 TENT5B-PRKAA2轴可能是调控胃癌细胞铁死亡的关键通路

近年来，铁死亡在胃癌发生发展中的作用受到越来越多的关注。一些调控胃癌铁死亡的关键因子（如ACTL6A^[16]、SOX13^[17]、HTR2B^[18]）也已被鉴定，有望成为胃癌治疗的新兴靶点。但目前报道的铁死亡调控基因绝大多数是抑制铁死亡的，而对于铁死亡促进基因的作用和机制仍知之甚少。本研究发现过表达TENT5B可促进胃癌细胞的铁死亡，并且显著增加胃癌细胞对铁死亡诱导剂（Erastin）的敏感度，提示TENT5B可能是促进胃癌细胞铁死亡的关键基因。更重要的是，本研究发现TENT5B可能通过延长PRKAA2 mRNA的poly（A）尾，增加其稳定性，进而增加PRKAA2的翻译表达；而且，敲减PRKAA2可以完全逆转TENT5B过表达的抑癌作用，提示PRKAA2是介导TENT5B功能发挥的关键因子。

PRKAA2（又称为AMPKα2）作为AMPK合酶的核心组分，在调节细胞能量代谢中起关键作用^[19]。PRKAA2（AMPK）的表达下调或活性降低与多种肿瘤的发生、生长、转移、耐药和免疫密切相关^[20-23]。最新研究^[24-27]显示，PRKAA2（AMPK）还参与肿瘤细胞铁死亡的调控；而且，PRKAA2通过磷酸化不同的底物，在不同的肿瘤细胞中或不同的应激条件下发挥不同的生物学效应。例如，Song等^[24]发现PRKAA2介导的BECN1磷酸化可通过直接结合SLC7A11，抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白系统（简称system Xc^-）的活性，促进肿瘤细胞铁死亡。相反，Lee等^[26]发现能量应激介导的PRKAA2激活可通过促进乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化，阻断多聚不饱和脂肪酸（PUFA）的生物合成，抑制肿瘤细胞铁死亡。

目前，PRKAA2（AMPK）已被证实参与了胰腺癌^[27]、结直肠癌^[28-29]、卵巢癌^[30]、肺癌^[31-32]、肝癌^[33]、乳腺癌^[34]等肿瘤的铁死亡调控，但未见PRKAA2调控胃癌铁死亡的报道，而本研究填补了这一空白。与Song等^[24]发现的“AMPK-BECN1-SLC7A11”通路相呼应，笔者推测TENT5B可能通过稳定PRKAA2 mRNA，持续激活AMPK-BECN1轴，进而抑制system Xc⁻活性，加速脂质过氧化，构成胃癌铁死亡的新调控范式。不同于Lee等^[26]报道的能量应激条件下PRKAA2（AMPK）抑制铁死亡，本研究在胃癌中观察到PRKAA2促进铁死亡。机制差异可能源于：(1) 胃癌细胞高基线ROS负荷；(2) AMPK下游底物选择（BECN1或ACC）受微环境调控。此外，本研究首次将TENT5B介导的mRNA稳定性调控（多聚腺苷酸化）引入铁死亡领域，为理解AMPK表达的转录后调控提供了新视角。

3.3 TENT5B可作为胃癌mRNA治疗的潜在分子

本研究还通过动物实验初步验证了TENT5B的体内抑癌作用，有望为胃癌的铁死亡靶向治疗提供潜在分子。随着mRNA技术的飞速发展，mRNA疫苗和mRNA药物已成为抗肿瘤药物研发的新策略^[35-38]。相比传统的药物研发策略（如小分子化合物、单克隆抗体），mRNA药物具有靶标范围广、免疫原性低、生产快速、存储方便、价格低廉等优势，故已成为全球最具创新和潜力的疾病防治模式之一^[39-40]。因此，通过mRNA技术（包括基于脂质纳米颗粒的体内递送系统）制备TENT5B mRNA药物，并将其导入体内发挥抗癌作用，有望成为胃癌mRNA治疗的新方法。

综上所述，本研究首次揭示了TENT5B促进胃癌细胞铁死亡和抑制胃癌进展的生物学功能，初步阐明了TENT5B通过增强PRKAA2 mRNA稳定性上调PRKAA2表达的分子机制，为胃癌的精准防治提供了新策略和新方法。但本研究仍存在以下缺陷或不足：(1) TENT5B在胃癌中下调的分子机制尚不清楚；(2) TENT5B如何选择性识别并延长PRKAA2 mRNA poly（A）尾的直接证据不足。在后续研究中将对上述问题进行深入探讨，以进一步丰富TENT5B调控胃癌的分子生物学理论。未来，筛选在肿瘤中特异性低表达的抑癌基因，阐明其促进肿瘤细胞铁死亡的分子机制，并联合mRNA技术，研制高效低毒的抗肿瘤mRNA药物，将成为肿瘤基础研究和临床转化研究的新思路、新方向^[41]。基于mRNA技术和铁死亡靶向的mRNA疗法，也将开启肿瘤预防和治疗的新时代。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82303255)

国家自然科学基金资助项目(82400213)