circSMARCA5通过miR-181-5p/LAMP-2轴调控急性胰腺炎细胞炎症损伤的机制研究

Mechanism of circSMARCA5-mediated regulation of inflammatory injury in acute pancreatitis through the miR-181-5p/LAMP-2 axis

摘要

背景与目的 急性胰腺炎（AP）是一种以胰腺腺泡细胞损伤和炎症反应为特征的消化系统急症。环状RNA（circRNA）在炎症相关疾病中的调控作用受到广泛关注，但circSMARCA5在AP中的作用及机制尚不明确。本研究探讨circSMARCA5对AP细胞损伤的影响及其与miR-181-5p/LAMP-2轴的调控关系。 方法 采用雨蛙肽刺激AR42J细胞建立体外AP模型。采用qRT-PCR检测circSMARCA5、miR-181-5p及LAMP-2表达；MTT法检测细胞活力；ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6水平；双荧光素酶报告基因实验验证circSMARCA5与miR-181-5p、miR-181-5p与LAMP-2之间的靶向关系；通过过表达circSMARCA5、miR-181-5p和LAMP-2进行功能回复实验。 结果 雨蛙肽处理后AR42J细胞中circSMARCA5表达显著降低，而miR-181-5p表达明显升高（均P<0.05）。过表达circSMARCA5可显著提高细胞活力，降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平（均P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验表明，circSMARCA5可直接结合miR-181-5p，LAMP-2为miR-181-5p的靶基因。miR-181-5p过表达可抑制LAMP-2表达，降低细胞活力并促进炎症因子释放，而circSMARCA5或LAMP-2过表达均可部分逆转上述作用。 结论 circSMARCA5在AP细胞模型中表达下调，其可通过竞争性吸附miR-181-5p上调LAMP-2表达，减轻炎症反应并改善细胞损伤。circSMARCA5/miR-181-5p/LAMP-2轴可能成为AP治疗的新型分子靶点。

Abstract

Background and Aims Acute pancreatitis (AP) is an acute gastrointestinal emergency characterized by damage to pancreatic acinar cells and an inflammatory response. Circular RNAs (circRNAs) have been implicated in the regulation of various inflammatory disorders; however, the role of circSMARCA5 in AP remains unclear. This study aimed to investigate the function of circSMARCA5 and its underlying mechanism involving the miR-181-5p/LAMP-2 axis in AP. Methods An in vitro AP model was established by treating AR42J cells with cerulein. The expression levels of circSMARCA5, miR-181-5p, and LAMP-2 were determined by qRT-PCR. Cell viability was assessed using the MTT assay, and the levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 were measured by ELISA. Dual-luciferase reporter assays were performed to verify the interactions between circSMARCA5 and miR-181-5p as well as between miR-181-5p and LAMP-2. Gain-of-function and rescue experiments were conducted to evaluate their biological effects. Results CircSMARCA5 expression was significantly decreased, whereas miR-181-5p expression was markedly increased in cerulein-treated AR42J cells (all P<0.05). Overexpression of circSMARCA5 significantly enhanced cell viability and reduced the secretion of TNF-α, IL-1β, and IL-6 (all P<0.05). Dual-luciferase reporter assays confirmed that circSMARCA5 directly bound to miR-181-5p, while LAMP-2 was identified as a downstream target of miR-181-5p. Overexpression of miR-181-5p suppressed LAMP-2 expression, decreased cell viability, and aggravated inflammatory responses. These effects were partially reversed by circSMARCA5 or LAMP-2 overexpression. Conclusion CircSMARCA5 alleviates inflammatory injury in AP by acting as a competing endogenous RNA for miR-181-5p and thereby upregulating LAMP-2 expression. The circSMARCA5/miR-181-5p/LAMP-2 regulatory axis may represent a potential therapeutic target for AP.

Graphical abstract

关键词

胰腺炎 / RNA，环状 / 微RNAs / 溶酶体相关膜蛋白质2

Key words

Pancreatitis / RNA, Circular / MicroRNAs / Lysosomal-Associated Membrane Protein 2

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一种影响消化系统的常见急性炎症，其发病机制被认为起源于胰腺腺泡细胞（pancreatic acinar cells，PAC）。各种病因可促发这些细胞的损伤，并可能升级为全身炎症反应，甚至导致全身多器官功能障碍综合征^[1]。近年来，AP全球年发病率约为30~45/10万，且呈上升趋势^[2-3]。因此，全面了解AP的分子途径并制定新的治疗策略势在必行。

研究^[4-5]表明抑制自噬可能通过减少胰腺细胞坏死来减轻AP，尽管自噬在AP发生和发展中的具体作用仍不明确。自噬广泛存在于真核细胞生理和病理中^[6]。自噬过程涉及自噬通量^[7-8]：在饥饿、应激或病理状态等刺激下，自噬前体在细胞质中形成，延伸包裹细胞内物质被降解或受损的细胞器，形成自噬体；然后这些自噬体与溶酶体融合，通过溶酶体相关膜蛋白2（LAMP-2）的作用降解。但某些病理生理刺激可阻碍这一过程，导致细胞损伤。有研究假设，这些空泡的形成可能源于自噬流被阻断。进一步的研究^[9-10]表明，LAMP-2表达显著下调，自噬体的积累远远超过自噬溶酶体。综上所述，在AP的发生过程中，PAC中LAMP-2的下调阻碍了自噬体与溶酶体的融合，导致自噬通量受损。虽然大量研究证实LAMP-2的下调引起自噬通量的阻断，但这种下调的确切机制仍未被探讨。这种理解上的差距阻碍了通过靶向下调LAMP-2逆转受损自噬通量的潜在治疗方法，从而严重限制了这一理论的转化应用。因此，阐明LAMP-2在AP中下调背后的机制至关重要。

大量研究证明，环状RNA（circRNA）在多种疾病中发挥着至关重要的功能。研究^[11]发现，circPTPRA通过海绵miR-140-5p在胰腺导管腺癌的进展中发挥重要作用。circMTO1通过与miR-9结合抑制肝癌进展^[12]。SMARCA5蛋白参与AP及后续癌变调控。而circSMARCA5作为竞争性内源RNA（ceRNA）或miRNA“海绵”，虽与多种肿瘤相关，但尚未发现其与AP的直接关联。来源于SMARCA5基因第15和第16外显子区域的circRNA已被证明可以抑制肝癌的生长和扩散^[13]，然而它们在胰腺疾病中的作用仍未得到充分探索。微小RNA（miRNA）代表了一类进化上保存的、序列中跨越18~25个核苷酸的短链非编码RNA实体。miRNA通过附着在靶mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）调节基因表达，从而抑制蛋白质合成或促进mRNA降解^[14-15]。miRNA与多种细胞机制有关，包括细胞生长、细胞周期调控、凋亡和细胞分化^[16]。miR-181轴被认为与炎症通路高度相关^[17]。

既往研究提示LAMP-2下调导致自噬通量障碍是AP发生发展的重要机制，但其上游调控网络尚未完全阐明。circRNA作为重要的转录后调控因子，可通过竞争性结合miRNA调控靶基因表达。然而，circSMARCA5在AP中的生物学作用及其是否通过miR-181-5p/LAMP-2轴参与AP病理过程尚未见报道。因此，本研究拟构建体外AP模型，探讨circSMARCA5、miR-181-5p与LAMP-2之间的调控关系及其对PAC炎症损伤的影响，以期为AP的分子机制研究及靶向治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和处理

PAC细胞AR42J（成都正能生物科技有限公司）在含10%胎牛血清（美国Gibco公司）和抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）的DMEM（美国Gibco公司）中于37 ℃、5% CO₂环境中培养。用10 nmol/L雨蛙肽处理AR42J细胞构建AR42J细胞体外AP模型。

1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

收集培养48 h的待测细胞上清液后，用肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒（日本Takara Bio公司）定量测定AR42J细胞上清液中上述细胞因子浓度。

1.3 qRT-PCR

用TRIzol试剂（美国Life Technologies公司）从培养的AR42J细胞中提取总RNA。使用FastKing RT试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。随后用SYBR green PCR试剂盒（日本Takara Bio公司）进行qRT-PCR，以U6或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。

1.4 MTT实验

将AR42J细胞接种于96孔板中，贴壁24 h，分别孵育4、6、8 h。孵育后，加入20 µL MTT（美国Thermo Fisher公司），再放置细胞4 h。弃去上清液后，向各孔中加入150 µL DMSO，并在Multiskan SkyHigh荧光分光光度计（美国Thermo Fisher公司）中于570 nm波长处测定吸光度。活细胞百分比计算为处理细胞与对照细胞的平均吸光度比值。

1.5 细胞转染

circSMARCA5和LAMP-2的pcDNA过表达载体及各自空载体对照（pcDNA3.1），miR-181-5p模拟物和模拟物对照由GenePharma（上海）生产。采用Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司）将上述组分转染AR42J细胞中。

1.6 Western blot

用细胞裂解液充分裂解培养48 h的待测细胞，提取总蛋白，测定浓度并进行变性。蛋白质用于SDS-PAGE电泳。电泳后聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质用电转仪转移到NC膜上。在环境条件下，用5%脱脂奶粉封闭膜2 h。随后，将膜暴露于稀释的一抗溶液（LAMP-2抗体1∶200）中，在4 ℃下孵育12~15 h。然后，将膜置于稀释的二抗溶液（辣根过氧化物酶标记的二抗1∶1 000）中，在37 ℃下孵育1 h。最后，使用ECL化学发光试剂盒对膜进行显影，并在化学发光成像系统下曝光。

1.7 生物信息学分析

利用lncRNA数据库DIANA（http://carolina.imis.athena-innovation.gr）预测miR-181-5p与circSMARCA5、LAMP-2的结合位点。

1.8 双荧光素酶报告基因试验

将携带miR-181-5p结合位点circSMARCA5或LAMP-2 3-UTR的野生型（WT）序列和miR-181-5p结合位点突变型（MT）序列掺入pmirGLO荧光素酶载体（武汉基因科技有限公司）中，生成荧光素酶报告载体circSMARCA5-WT、circSMARCA5-MT、LAMP-2-WT或LAMP-2-MT。这些荧光素酶报告基因构建体（100 ng）随后与miR-181-5p模拟物或miR阴性对照（miR-NC）（50 ng）一起用Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司）共同转染AR42J细胞。最终采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒评价发光活性。

1.9 统计学处理

使用GraphPad Prism 9软件进行分析。数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，并采用Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行统计学评估。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 雨蛙肽处理的AR42J细胞中circSMARCA5表达及生物学行为的变化

qRT-PCR检测结果显示，与对照组（无处理的AR42J细胞）比较，雨蛙肽处理的AR42J细胞circSMARCA5表达水平明显降低，且随着时间的推移逐渐下降（均P<0.05）（图1A）。MTT实验结果显示，雨蛙肽处理的AR42J细胞的活力在各时间点均较对照组细胞明显减弱（均P<0.05）（图1B）。ELISA结果显示，雨蛙肽处理的AR42J细胞中的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平均较对照组细胞明显升高（均P<0.05）（图1C）。

2.2 circSMARCA5促进AR42J细胞增殖并抑制炎症反应

将circSMARCA5过表达质粒转染AR42J细胞后，转染效率分析结果显示，转染后的AR42J细胞与空白对照细胞（无处理AR42J细胞）及阴性对照细胞（转染空载体的AR42J细胞）相比，circSMARCA5表达明显升高（均P<0.05）（图2A）。MTT实验结果显示，转染circSMARCA5过表达质粒后，雨蛙肽对AR42J细胞活力的抑制作用被部分逆转（P<0.05）（图2B）。ELISA实验结果显示，转染circSMARCA5过表达质粒后，雨蛙肽诱导AR42J细胞TNF-α、IL-1β和IL-6释放的作用被明显抑制（均P<0.05）（图2C）。

2.3 circSMARCA5对miR-181-5p的靶向调控及其功能

DIANA数据库预测结果显示，circSMARCA5和miR-181-5p之间存在靶向结合序列（图3A）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，共转染miR-181-5p模拟物后，AR42J细胞中circSMARCA5-WT的荧光素酶活性明显降低（P<0.01），而circSMARCA5-MT的活性基本不变（P>0.05）（图3B），表明circSMARCA5和miR-181-5p之间存在直接相互作用。qRT-PCR实验证实，加入miR-181-5p模拟物后，miR-181-5p的表达明显升高，表明转染成功（P<0.05）（图3C）；过表达circSMARCA5导致miR-181-5p表达明显下调（P<0.01）（图3D）。当用雨蛙肽处理AR42J细胞后，miR-181-5p的表达明显升高，且随着时间的推移（4、6、8 h）逐渐增加（P<0.05、P<0.05、P<0.01）（图3E）。为分析在雨蛙肽诱导的AP过程中miR-181-5p与circSMARCA5的相互作用，用circ-SMARCA5过表达质粒和（或）miR-181-5p模拟物转染AR42J细胞。MTT实验结果显示，与空白对照细胞比较，转染miR-181-5p模拟物后，AR42J细胞的增殖活性明显降低，且随着时间的推移逐渐减弱，炎症标志物TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显升高（均P<0.05），而同时转染circSMARCA5过表达质粒后，miR-181-5p模拟物的上述作用被明显逆转（均P<0.05）（图3F-G）。

2.4 miR-181-5p对LAMP-2的靶向调控及其功能

DIANA数据库预测miR-181-5p和LAMP-2之间存在靶结合序列（图4A）。qRT-PCR结果显示，转染miR-181-5p模拟物后，AR42J细胞LAMP-2 mRNA表达明显下降（P<0.01），LAMP-2蛋白水平明显下调（图4B-C）。LAMP-2-WT和LAMP-2-MT构建体结合miR-181-5p模拟物的荧光素酶活性检测显示，与miR-181-5p模拟物共转染后，AR42J细胞中LAMP-2-WT的相对荧光素酶活性明显减弱（P<0.01），而LAMP-2-MT的活性不受影响（P>0.05）（图4D）。qRT-PCR和Western blot检测证实，当LAMP-2过表达时，mRNA和蛋白表达增加（图4E-F）。在雨蛙肽处理的AR42J细胞上，在转染miR-181-5p模拟物的基础上，同时转染LAMP-2过表达质粒，miR-181-5p模拟物对AR42J细胞的增殖活性的抑制以及对促炎细胞因子的诱导作用被明显逆转（均P<0.05）（图4G-H）。

3 讨　论

circRNA是一种闭合环状单链RNA分子长度通常在数百到数千核苷酸，在转录后加工过程中形成，通常不具有编码蛋白质的功能^[18]。研究表明，circRNA参与多样的生物学过程，包括细胞周期、细胞分化和细胞衰老，因此circRNA是细胞内重要的调控RNA。目前对circSMARCA5的研究主要集中在肝癌，研究发现其在肝癌生长和转移中至关重要^[13]。也有报道过表达circSMARCA5可激活SRSF1/β-catenin轴，逆转oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖抑制，可能为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点^[19]。

本研究最初观察到circSMARCA5在雨蛙肽处理的PAC中表现出表达减少。发现circSMARCA5水平升高可降低炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，从而减缓炎症的进展。这些发现证实circSMARCA5可能通过其对细胞死亡和炎症过程的影响阻碍雨蛙肽诱导的AP的进展，突出了其在AP中的潜在重要性。

miRNA是一种非编码RNA，对人类各种疾病的病理过程产生相当大的影响。有研究^[20]表明，miRNA在肿瘤发生发展中可作为癌基因或抑癌基因发挥作用。此外，miRNA与细胞过程有关，包括增殖、凋亡、转移和受体驱动的通路^[21]。文献综述揭示，miR-181-5p在多种类型的癌症中起抑癌作用^[22-24]。研究表明，circRNA可以通过几种机制发挥作用：⑴ 作为miRNA的“海绵”；⑵ 与蛋白结合相互作用；⑶ 翻译成多肽。circRNA已被广泛报道为通过ceRNA机制调控基因表达的重要分子^[25-27]。研究发现多个circRNA拥有一个或多个miRNA结合位点，使其充当吸附miRNA的“海绵”。通过隔离miRNA，这些circRNA能够通过ceRNA机制调节被miRNA抑制的下游靶基因的表达^[25]。

miRNA介导的转录后调控在AP的炎症反应和细胞损伤过程中具有重要作用，而circRNA通过充当miRNA“海绵”构建ceRNA调控网络已成为近年来的研究热点。本研究证实circSMARCA5能够与miR-181-5p直接结合，并在雨蛙肽诱导的AR42J细胞中呈现低表达，而miR-181-5p则呈现高表达。功能实验进一步表明，circSMARCA5过表达能够显著提高细胞活力并降低TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子水平，而miR-181-5p过表达则产生相反作用，并部分抵消circSMARCA5的保护效应。上述结果提示，circSMARCA5可能通过竞争性吸附miR-181-5p发挥抗炎和细胞保护作用。鉴于miRNA主要通过调控下游靶基因发挥生物学效应，本研究进一步对miR-181-5p的下游靶基因进行了筛选和验证，以期阐明circSMARCA5参与AP调控的具体分子机制。

溶酶体的单层膜维持了腔内酸性环境与胞质之间的区隔。该膜含有独特的蛋白质，LAMP-2约占总溶酶体膜蛋白的50%^[28-29]。研究^[30]表明，LAMP-2表达下降在AP的初始阶段是至关重要的。Exendin-4已被证明通过下调LAMP-2抑制胰腺腺泡AR42J细胞自噬流诱导细胞凋亡^[31]。溶酶体相关膜蛋白对于维持PAC稳态至关重要，LAMP-2缺陷小鼠发生胰腺炎^[10]。这些发现表明LAMP-2在AP的发生中起着重要的作用。本研究中观察到miR-181-5p和LAMP-2表达之间存在负相关关系。双荧光素酶报告基因检测发现，共转染miR-181-5p模拟物后，LAMP-2-WT的相对荧光素酶活性显著降低，而LAMP-2-MT的活性基本保持不变。雨蛙肽处理AR42J细胞后，随着时间的推移，加入miR-181-5p模拟物，PAC的增殖逐渐下降，与炎症标志物TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著升高相吻合。这表明AP进行性加重。相反，LAMP-2过表达后，细胞增殖得到改善，表明病理程度减轻。综上所述，过表达LAMP-2可以抑制miR-181-5p介导的雨蛙肽诱导的AP。

本研究通过生物信息学分析预测miR-181-5p与LAMP-2之间存在潜在结合位点，并通过双荧光素酶报告基因实验进一步证实LAMP-2是miR-181-5p的直接靶基因。qRT-PCR及Western blot检测结果显示，miR-181-5p过表达可显著抑制LAMP-2的mRNA及蛋白表达水平。进一步功能实验发现，miR-181-5p过表达能够降低AR42J细胞活力并促进TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的释放，而LAMP-2过表达可部分逆转上述作用。结合前述结果可知，circSMARCA5通过竞争性吸附miR-181-5p，减弱其对LAMP-2的抑制作用，从而维持LAMP-2表达水平并减轻炎症损伤。上述结果提示，circSMARCA5可能通过调控miR-181-5p/LAMP-2轴维持自噬稳态，在AP发生发展过程中发挥保护作用，为AP的分子调控网络提供了新的实验依据。

本研究仍存在一定局限性。首先，仅采用AR42J细胞构建体外AP模型，缺乏动物实验及临床样本验证；其次，本研究主要关注circSMARCA5/miR-181-5p/LAMP-2调控轴对炎症反应的影响，尚未进一步检测自噬相关指标及自噬通量变化；此外，circSMARCA5是否还存在其他下游靶点有待进一步研究。未来仍需结合体内实验和临床样本开展深入验证。

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基金资助

山西省太原市科学技术局科技计划基金资助项目(202247)

山西省基础研究计划基金资助项目(202303021212363)

山西省基础研究计划基金资助项目(202303021222379)