肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内最常见的原发性肝脏恶性肿瘤。其发病率和病死率居高不下，尤其在中国等亚洲国家疾病负担沉重。尽管手术切除、肝移植、局部介入治疗、靶向药物等治疗手段不断进步
[1-5]，但HCC患者总体5年总生存（overall survival，OS）率仍不理想，主要原因是确诊时多数患者已处于中晚期，且术后复发转移率高
[6]。近年来，以免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICI）为代表的肿瘤免疫治疗在晚期HCC治疗中展现出显著疗效，但仅有部分患者能够从中获益
[7-8]。因此，深入探索HCC免疫微环境特征，寻找预测免疫治疗疗效的生物标志物，并开发新的联合治疗策略以提高免疫治疗应答率，成为当前HCC研究的热点领域。
三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）是一种在慢性炎症组织或肿瘤微环境中异位形成的、有组织的免疫细胞聚集体，其在结构和功能上类似于次级淋巴器官，但缺乏包膜结构。TLS通常包含B细胞区、T细胞区、生发中心以及高内皮微静脉（high endothelial venules，HEV）等结构成分，能够原位启动和维持适应性免疫应答
[9-11]。与淋巴结等次级淋巴器官不同，TLS是在病理条件下新生形成的，其存在反映了局部持续存在的抗原刺激和炎症状态。肝脏作为具有独特免疫耐受特性的器官，其微环境倾向于诱导免疫耐受而非免疫激活，这使得TLS在肝脏中的形成尤为依赖于强烈的炎症信号以克服这种免疫耐受状态
[4]。在HCC中，TLS已成为肿瘤免疫研究的前沿领域。近年来，多项研究表明，TLS的存在、成熟度及空间分布与HCC患者的临床预后和对免疫治疗的反应密切相关
[12]。成熟的TLS能够通过促进肿瘤抗原特异性T细胞和B细胞的活化与扩增，增强抗肿瘤免疫应答，从而抑制肿瘤进展和转移
[13-15]。此外，某些治疗手段[如肝动脉灌注化疗（hepatic arterial infusion chemotherapy，HAIC）、局部放疗等]被证实能够诱导TLS形成或促进其成熟，进而增强免疫治疗疗效
[16-17]。本综述系统阐述了TLS的生物学特性、形成机制、在HCC预后预测和免疫治疗中的价值，以及靶向TLS的治疗策略，旨在为深入理解TLS在HCC免疫微环境中的作用及推动其临床转化提供参考（
图1）。
1 TLS的形成机制与成熟分级
1.1 TLS的细胞与分子调控机制
TLS的形成是一个高度有序的过程，涉及多种免疫细胞和基质细胞之间的复杂相互作用，以及多种趋化因子和细胞因子的精密调控。这一过程始于慢性炎症或肿瘤微环境中的初始信号刺激，如持续的抗原暴露、组织损伤或炎症因子释放
[18]。这些信号诱导局部细胞分泌关键趋化因子，包括CXCL13、CCL19和CCL21等
[9-10,14,19]，其中，CXCL13通过招募B细胞促进滤泡形成，而CCL19和CCL21则引导T细胞和树突状细胞（dendritic cells，DC）归巢
[20-21]。
淋巴组织诱导细胞（lymphoid tissue inducer cells，LTi）作为先天淋巴样细胞的一个亚群，通过表达表面分子，淋巴毒素α1β2（lymphotoxin α1β2，LTα1β2），与基质细胞上的淋巴毒素β受体（lymphotoxin beta receptor，LTβR）结合，启动淋巴组织形成程序，诱导基质细胞表达多种黏附分子[如血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）]和趋化因子，从而招募更多的免疫细胞形成淋巴细胞聚集的初始结构
[10,22]。随着TLS逐渐发育成熟，滤泡辅助T细胞通过分泌CXCL13促进B细胞聚集和滤泡形成；同时，滤泡树突状细胞（follicular dendritic cells，FDC）形成网络结构，支持B细胞的活化和增殖
[20-21]。
近年来研究
[23]发现，代谢重编程在TLS的形成和功能调控中起着至关重要的作用。例如HCC细胞中高表达的色氨酸代谢酶色氨酸2，3-双加氧酶2（tryptophan 2，3-dioxygenase 2，TDO2）通过消耗微环境中的色氨酸并产生犬尿氨酸等代谢产物，创造免疫抑制性微环境，阻碍TLS的成熟
[24]。而使用TDO2抑制剂或低色氨酸饮食则能逆转这一抑制，促进功能性TLS的形成
[24]。此外，病毒性肝炎背景下的HCC其瘤周肝组织中TLS的密度显著更高，但新辅助免疫治疗的应答者中，瘤内TLS的密度显著升高，且不受乙型肝炎病毒背景的影响。
目前研究认为，TLS的形成是一个多细胞、多信号分子协同参与的动态过程，其中多种趋化因子、细胞因子及信号分子发挥关键作用，其主要分子及功能总结见
表1。
1.2 TLS的成熟阶段与评估方法
根据组织结构复杂程度和细胞组成，TLS可分为不同的成熟阶段（
表2）。早期TLS主要由分散的T细胞和B细胞混合聚集而成，缺乏明显的分区结构。初级滤泡样TLS开始出现T细胞区和B细胞区的分离，但尚未形成生发中心。最成熟的次级滤泡样TLS则具备明显的生发中心，含有CD21
+ FDC和Ki-67
+增殖性B细胞，能够支持完整的体液免疫应答
[25]。研究
[26-27]表明，成熟TLS的抗肿瘤免疫功能最强，其预后预测价值也最高。有研究
[28-29]引入了人工智能和数字病理技术，对TLS进行更精细的定量分类，例如，将其分为“趋向成熟型”和“非成熟型”，从而更精准地评估其功能状态。
评估TLS通常采用组织学方法，包括常规HE染色和免疫组织化学或免疫荧光染色。HE染色可以初步识别TLS的存在和基本结构，而通过免疫组化检测特定标志物则能更精确地分析TLS的细胞组成和成熟阶段。常用的标志物包括CD3（T细胞）、CD20（B细胞）、CD21/CD23（FDC网络）、PNAd（HEV）和DC-LAMP（成熟DC）等
[26,28,30]。借助多重免疫荧光和空间转录组学等新技术，研究人员现已能在单细胞及空间原位层面，深入解析TLS的细胞构成、胞间互作与基因表达。这些技术突破极大地深化了我们对TLS异质性及其功能的认知
[10]。
1.3 TLS的双重功能特性
TLS在肿瘤微环境中的作用并非单一方向的，而是表现出明显的双重性，即从抗肿瘤到促肿瘤的功能谱系
[31]。这种功能双重性与TLS的发育状态、细胞组成、空间位置以及所在的微环境因素密切相关。在大多数情况下，具有生发中心的成熟TLS被认为是执行抗肿瘤免疫应答的核心结构，通过支持B细胞和T细胞的活化与扩增发挥抑制肿瘤进展的作用。然而，空间转录组学的精细分析揭示了传统意义上“不成熟”TLS内部存在显著的功能分化
[24]：一类是趋向成熟型TLS，其B细胞遵循与成熟TLS相似的发育轨迹，具有向成熟发展的潜能，高表达CXCL9及B细胞发育关键转录因子，虽然细胞组成混乱但具备抗肿瘤潜能，并对ICI治疗产生响应；另一类是偏离成熟型TLS，其B细胞发育轨迹偏离正常成熟路径，高表达色氨酸代谢通路相关基因[如TDO2，吲哚胺2，3-双加氧酶2（indoleamine 2，3-dioxygenase 2，IDO2）]以及免疫负调控基因DNA结合抑制物2（inhibitor of DNA binding 2，ID2），其微环境中肿瘤细胞的异常色氨酸代谢营造了免疫抑制环境，导致TLS功能失常并与免疫治疗耐药及不良预后相关。在某些情况下，不成熟的TLS或含有大量免疫抑制性细胞（如调节性T细胞、调节性B细胞）的TLS可能不利于抗肿瘤免疫，甚至促进肿瘤进展
[28,32]。此外，TLS的空间位置也影响其功能走向。例如在HCC中，位于瘤周的成熟TLS通常与较好的预后相关，而位于肿瘤内部的未成熟TLS则可能与免疫抑制性微环境相关
[10,14]。因此，在评估TLS的临床意义时，需要综合考虑其多种特征。
2 TLS在肝癌中的预后与预测价值
2.1 TLS存在与肝癌预后的关系
多项临床研究证实，TLS的存在与HCC患者改善的临床预后显著相关。一项针对术后HCC组织样本的研究发现，肿瘤组织内存在TLS的患者，其OS和无复发生存期（recurrence free survival，RFS）均显著延长，TLS阳性患者的5年OS率明显高于TLS阴性患者，表明TLS可以作为HCC预后的积极预测指标
[29,33]。另有研究发现，与TLS的存在状态相比，TLS的密度似乎可更准确地评估患者的预后，其密度越高，患者预后相对越好
[13,25,34]。联合TLS和其他临床、病理、影像特征的HCC风险分层和预测模型也成为研究热点
[35-36]。
TLS的抗肿瘤机制主要与其能够原位激活和扩增肿瘤特异性T细胞和B细胞有关
[11,20-21]。在TLS内部，DC等抗原呈递细胞高效捕获并处理肿瘤抗原，随后将其精准呈递给CD4
+和CD8
+ T细胞，从而触发特异性抗肿瘤免疫。同时，B细胞在TLS中完成克隆扩增、体细胞高频突变及抗体类别转换，产生高亲和力的抗体。这些免疫应答协同作用，在一定程度上遏制了肿瘤的生长与转移。
2.2 TLS成熟度与定位对预后的影响
值得注意的是，TLS的成熟度对其预后价值也有重要影响
[29]。研究
[26,29]表明，具有生发中心的成熟TLS（SFL-TLS）比不成熟TLS（E-TLS）表现出更强的抗肿瘤免疫活性，与患者预后相关性也更显著。这可能是因为生发中心支持B细胞的高效活化和抗体亲和力成熟，产生更有效的抗肿瘤体液免疫应答。有研究
[30]将TLS成熟度用于患者OS和疾病进展风险分层，与TLS的存在状态和密度相比，成熟度评估患者预后更为简便高效。有研究认为，只有SFL-TLS才具有有效的抗肿瘤能力，而E-TLS内部细胞组成和空间结构不完善，无法形成有效的抗肿瘤适应性免疫反应。
除了存在状态与成熟度，TLS的空间分布同样关键。研究发现，位于瘤周的TLS通常聚集了更多活化的免疫细胞；相较于肿瘤核心区的TLS，其表现出更显著的抗肿瘤免疫活性与预后价值
[14]。这可能是因为免疫细胞更容易在瘤周区域聚集并接受抗原刺激。近年来研究还发现，TLS中的B细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，可能超过T细胞的作用
[15,37]。在HCC中，TLS内B细胞的存在和功能状态与患者OS延长显著相关。B细胞不仅通过产生肿瘤特异性抗体直接杀伤肿瘤细胞，还通过抗原呈递和细胞因子分泌调节T细胞功能，是TLS抗肿瘤免疫的核心组分。鉴于TLS中B细胞浸润的独特价值，将其与现有的T细胞免疫评估体系相结合，能够更全面地刻画肿瘤免疫微环境。这种多维度评估有望显著提升对患者预后及免疫治疗应答预测的精准度。
2.3 TLS对免疫治疗疗效的预测作用
随着ICI在HCC治疗中的应用日益广泛和疗效异质性的凸显，寻找预测ICI疗效的生物标志物成为临床研究的重点。多项研究
[15,20,27,38]表明，TLS的存在和成熟度可以预测HCC患者对抗PD-1/PD-L1治疗的反应。在接受抗PD-1治疗的HCC患者中，治疗前肿瘤组织内存在成熟TLS的患者，其客观缓解率和疾病控制率均高于无TLS或仅有不成熟TLS的患者
[25,30,39]。此外，有限的研究表明治疗后TLS数量的增加和成熟度的提升与更好的治疗反应相关，提示动态监测TLS变化可能有助于评估免疫治疗疗效
[40]。
TLS增强免疫治疗疗效的可能机制
[10-11,41-42]包括：(1) TLS内聚集了大量活化的T细胞和B细胞，为ICI提供了作用靶点；(2) TLS支持持续的T细胞活化和增殖，防止T细胞耗竭；(3) TLS内的B细胞通过产生抗体和调节T细胞功能，增强抗肿瘤免疫应答。但以上推断仍有待高质量研究证实。因此，治疗前肿瘤组织内存在TLS，可能有助于筛选出最有可能从免疫治疗中获益的HCC患者。值得注意的是，不同HCC亚型中TLS的分布和功能可能存在差异。基于免疫基因表达谱的分析可将HCC分为免疫激活型和免疫静止型，这些亚型中TLS的特征和功能可能不同，对其预后预测价值产生影响
[24]。因此，在将TLS作为生物标志物时，需要考虑HCC的分子分型及肿瘤异质性。
3 TLS相关治疗策略与临床转化前景
3.1 抗肿瘤治疗诱导TLS形成
鉴于TLS在抗肿瘤免疫中的重要作用，诱导TLS形成或促进其成熟已成为HCC免疫治疗的新策略。研究显示，目前针对HCC的多种治疗手段能够诱导调节TLS的形成。
HAIC是一种针对晚期HCC的局部治疗方法。研究
[40]发现，FOLFOX方案的HAIC治疗可显著促进HCC组织内TLS的形成。机制上，HAIC可能通过诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，释放肿瘤抗原和损伤相关分子模式，激活DC，进而启动TLS形成级联反应。同时，HAIC治疗可激活中央记忆样CD4
+ T细胞，通过LTβ-LTβR信号轴与癌症相关成纤维细胞和巨噬细胞相互作用，促进TLS生成
[40,43]。
放射治疗也被证实能够诱导TLS形成。放疗可通过引起肿瘤细胞DNA损伤，激活cGAS-STING通路，促进I型干扰素等促炎因子的产生，创造有利于TLS形成的炎症微环境
[44]。此外，放疗还可能通过破坏肿瘤血管系统，促进淋巴细胞浸润和聚集，间接支持TLS形成。
靶向药物如血管内皮生长因子抑制剂可通过促进血管正常化，改善免疫细胞浸润和功能，间接支持TLS的形成和维持
[45]。一些研究
[14,24]还发现，某些小分子抑制剂如IDO1抑制剂，可通过调节色氨酸代谢，改善TLS内免疫细胞的功能，促进TLS成熟。ATP柠檬酸裂解酶抑制可促进TLS形成，通过上调CXCL13招募B细胞，增强抗肿瘤免疫
[46]。
3.2 趋化因子/细胞成分诱导TLS形成
通过趋化因子、细胞成分直接靶向TLS内特定组分或信号通路也成为诱导TLS形成的方向。局部给予关键趋化因子（如CXCL13、CCL21等）或其激动剂，可以直接促进淋巴细胞的招募和TLS形成
[11,18-19]。有研究
[47]证实在胰腺癌病灶内注射表达CXCL13/CCL21的病毒载体可有效诱导TLS形成，增强抗肿瘤免疫应答，将吉西他滨与肿瘤内淋巴化学趋化因子共同给药，改变了免疫细胞的浸润，并增强了化疗的抗肿瘤活性。通过激活LTβR信号通路，模拟生理性淋巴器官形成过程，也可诱导TLS新生，并增强免疫治疗疗效
[22,48]。细胞过继治疗将体外扩增的肿瘤特异性T细胞或B细胞回输至患者体内，这些细胞可能归巢至TLS，增强其免疫功能
[10-11]。特别是表达CXCR5的Tfh样细胞或B细胞，表现出更强的TLS趋向性，是增强免疫功能的重要细胞亚群。此外，肿瘤疫苗、菌群移植等也是诱导TLS形成的可能策略
[49]。
3.3 临床挑战与解决方案
尽管靶向TLS的治疗策略前景广阔，但其临床转化仍面临诸多复杂挑战。首先，TLS在不同个体、不同肿瘤类型乃至同一肿瘤的不同区域间存在显著的异质性，这种差异不仅体现在空间分布和密度上，也体现在结构成熟度和功能状态方面。因此，构建一套标准化评估体系已成为实现精准医疗的核心任务，该体系旨在精准识别那些富含“抗肿瘤型”TLS的患者亚群，因为这部分人群最有可能从TLS诱导治疗或靶向干预中显著获益。其次，诱导TLS形成的最佳治疗窗口、给药剂量、频率及递送途径均有待系统优化。例如，全身性给药虽覆盖面广，但易引发非预期的自身免疫损伤；相比之下，局部给药虽安全性较高，却受限于操作的技术门槛，且难以兼顾远处微转移灶。此外，干预时机的选择同样关键，无论是免疫治疗前的预处理，还是同步实施，其安全性风险与临床获益模式均存在显著差异
[21,50]。此外，肿瘤微环境中固有的强大免疫抑制网络，如Treg细胞、髓源性抑制细胞、抑制性癌细胞相关成纤维细胞等，可能抵消或削弱新生TLS的免疫功能，甚至将其转化为免疫抑制性微环境的一部分。这意味着，单纯的TLS诱导策略可能不足，必须与靶向这些免疫抑制因素的疗法进行联合，设计出多管齐下的协同干预策略，方能克服微环境抵抗，真正释放TLS的抗肿瘤潜力。
4 总结与展望
TLS作为HCC肿瘤免疫微环境中的关键组成部分，在抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。大量临床证据表明，TLS的存在、密度、成熟度和空间分布与HCC患者更好的预后和对免疫治疗更强的应答显著相关，使其成为有前景的预后生物标志物和治疗靶点。尽管TLS研究取得了显著进展，但仍存在一些局限性：目前大多数TLS相关研究为回顾性分析，样本量相对较少，且来自单中心，缺乏前瞻性验证
[3,36]；另外，TLS的鉴定和分型标准尚不统一，尤其是在区分“趋向成熟型”与“偏离成熟型”这类新型亚型时，依赖于空间转录组等高通量技术，限制了其在临床病理检查中的推广应用。
未来HCC诊疗领域中TLS研究的重要方向包括：(1) 深入解析TLS异质性的细胞和分子基础，明确不同亚型TLS的功能差异；(2) 开发标准化、可临床转化的TLS评估系统；(3) 探索不同HCC治疗手段（如靶向治疗、免疫治疗、局部治疗）对TLS形成和功能的影响；(4) 开展精心设计的临床研究，优化针对TLS的治疗策略，包括最佳治疗时机、剂量和组合方案。随着单细胞测序、空间转录组学、多重免疫荧光等先进技术的广泛应用，以及对TLS形成和功能调控机制的深入理解，TLS有望成为HCC免疫治疗的重要靶点。通过精准调控TLS，可能实现将“免疫冷肿瘤”转化为“免疫热肿瘤”，从而提高免疫治疗疗效，改善HCC患者预后。
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