CLSTN3在结直肠癌中的促癌作用及其与淀粉样前体蛋白的相互作用研究

Oncogenic role of CLSTN3 in colorectal cancer and its interaction with amyloid precursor protein

摘要

背景与目的 CLSTN3是近年来新发现的结直肠癌（CRC）候选生物标志物，但其在CRC中的表达特征、临床意义及作用机制尚不明确。本研究探讨CLSTN3在CRC中的表达、预后价值及其与淀粉样前体蛋白（APP）的相互作用关系。 方法 收集313例CRC石蜡组织及17例新鲜组织标本，采用免疫组织化学及Western blot检测CLSTN3和APP表达，并分析其与临床病理特征及预后的关系。构建CLSTN3过表达HCT8细胞和CLSTN3敲减HCT116细胞模型，通过CCK-8实验及裸鼠皮下成瘤实验评估CLSTN3对CRC细胞增殖能力的影响。利用GeneMANIA数据库预测CLSTN3相关互作分子，并采用免疫共沉淀验证CLSTN3与APP的相互作用。 结果 CLSTN3在CRC组织及细胞系中的表达均明显高于正常组织及正常结肠细胞（均P<0.05）。免疫组化结果显示，CLSTN3在CRC组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织（68.7% vs. 27.2%）。CLSTN3高表达与TNM分期、肿瘤坏死及神经脉管侵犯密切相关（均P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，CLSTN3高表达患者的总体生存（OS）及无病生存（DFS）均明显降低（均P<0.001）。多因素Cox分析表明，CLSTN3高表达是CRC患者OS及DFS的独立危险因素。体外及体内实验结果显示，CLSTN3过表达可显著促进CRC细胞增殖及移植瘤生长，而CLSTN3敲减则明显抑制肿瘤生长。生物信息学分析提示APP可能是CLSTN3的重要互作分子。免疫共沉淀证实CLSTN3与APP在CRC细胞中存在直接相互作用。Western blot结果显示，CRC组织中CLSTN3与APP表达呈正相关（r=0.604，P=0.012），且二者在伴肿瘤坏死组织中的表达水平更高。 结论 CLSTN3在CRC中异常高表达，并通过促进肿瘤细胞生长参与CRC进展。CLSTN3高表达提示不良预后，其可能通过与APP相互作用发挥促癌效应。CLSTN3有望成为CRC新的预后标志物及潜在治疗靶点。

Abstract

Background and Aims CLSTN3 has recently been identified as a potential biomarker for colorectal cancer (CRC); however, its expression pattern, clinical significance, and underlying mechanisms in CRC remain unclear. This study aimed to investigate the biological role and prognostic value of CLSTN3 and its interaction with amyloid precursor protein (APP) in CRC. Methods A total of 313 paraffin-embedded CRC specimens and 17 fresh CRC tissue samples were collected. Immunohistochemistry and Western blot analyses were performed to evaluate the expression of CLSTN3 and APP and their associations with clinicopathological characteristics and prognosis. HCT8 cells with CLSTN3 overexpression and HCT116 cells with CLSTN3 knockdown were established. Cell proliferation was assessed using CCK-8 assays and nude mouse xenograft experiments. Potential interacting molecules of CLSTN3 were predicted using the GeneMANIA database, and the interaction between CLSTN3 and APP was validated by co-immunoprecipitation assays. Results CLSTN3 expression was significantly increased in CRC tissues and cell lines compared with normal controls (all P<0.05). Immunohistochemistry demonstrated that the positive expression rate of CLSTN3 was markedly higher in CRC tissues than in adjacent tissues (68.7% vs. 27.2%). High CLSTN3 expression was significantly associated with TNM stage, tumor necrosis, and neurovascular invasion (all P<0.05). Kaplan-Meier analysis showed that patients with high CLSTN3 expression had significantly worse overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) (both P<0.001). Multivariate Cox regression analysis identified CLSTN3 overexpression as an independent prognostic factor for both OS and DFS in CRC patients. Functional experiments demonstrated that CLSTN3 overexpression significantly promoted CRC cell proliferation and tumor growth in vivo, whereas CLSTN3 knockdown inhibited tumor growth. Bioinformatics analysis suggested APP as a key interacting molecule of CLSTN3. Co-immunoprecipitation assays confirmed a direct interaction between CLSTN3 and APP in CRC cells. Western blot analysis further showed a positive correlation between CLSTN3 and APP expression in CRC tissues (r=0.604, P=0.012), and both proteins were more highly expressed in tumors with necrosis. Conclusion CLSTN3 is aberrantly upregulated in CRC and promotes tumor progression by enhancing cancer cell growth. High CLSTN3 expression predicts poor prognosis and may exert oncogenic effects through interaction with APP. CLSTN3 may serve as a novel prognostic biomarker and potential therapeutic target for CRC.

Graphical abstract

关键词

结直肠肿瘤 / CLSTN3 / 淀粉样前体蛋白 / 预后

Key words

Colorectal Neoplasms / CLSTN3 / Amyloid Precursor Protein / Prognosis

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球癌症相关死亡的第二大致死原因^[1]。尽管在筛查和治疗方面取得了进展，但由于高转移和复发率以及对治疗药物的耐药性，CRC患者的总体生存（overall survival，OS）率仍然较低^[2]，凸显出迫切需要新的早期预警标志物和治疗靶点。

钙结合蛋白家族（calsyntenins，CLSTN）是一类跨膜胞内转运蛋白，属于细胞黏附分子钙黏素（cadherin）超家族，包括三个成员：CLSTN1、CLSTN2和CLSTN3^[3]。研究发现CLSTN与多种人类疾病的关联，CLSTN1参与调控胃癌细胞迁移和侵袭转移^[4]。长链非编码的CLSTN2通过PI3K/Akt信号通路破坏氧化还原平衡，促进骨肉瘤进展^[5]。肿瘤血清蛋白组学筛查发现CLSTN3蛋白是CRC新的候选标志物和治疗靶点^[6]。迄今为止，CLSTN3在CRC中的作用和机制尚未被研究。

本研究旨在通过检测CLSTN3在CRC组织及细胞系中的表达水平；通过体外细胞实验和裸鼠体内成瘤实验评估CLSTN3对CRC细胞生长能力的影响；利用GeneMANIA数据库预测与CLSTN3相互作用的潜在分子，并通过免疫共沉淀及临床组织样本相关性分析进行验证。结果表明，CLSTN3是CRC的不良预后标志物，其表达上调可促进CRC细胞生长。此外，本研究证实淀粉样前体蛋白（APP）是CLSTN3的关键互作蛋白，为理解CLSTN3的促癌功能提供了新的分子依据。

1 材料与方法

1.1 临床样本

癌与癌旁配对CRC石蜡组织样本共313例，来源于2019—2020年间于中南大学湘雅医院普通外科行手术切除的CRC患者。男185例，女128例；右半结肠癌69例，左半结肠癌88例，直肠癌156例。临床随访主要通过门诊、实地和户籍系统查询等方式完成，随访截止日期为2025年12月31日，无失访病例。癌与癌旁配对CRC新鲜组织样本共17例，来源于2024—2025年于中南大学湘雅医院普通外科行术切除的CRC患者，其中男13例，女4例；右半结肠癌2例，左半结肠癌3例，直肠癌12例。本课题研究内容已通过中南大学湘雅医院医学伦理委员会审批备案（批件编号：2022020062）。

1.2 免疫组化检测CLSTN3在CRC组织中的表达

石蜡切片置入60 ℃烤箱，烤片24 h。用二甲苯脱蜡，一系列梯度酒精水化，然后EDTA抗原修复液微波炉进行抗原修复10 min，PBS缓冲液洗涤。用3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性。切片在4 ℃下在封闭缓冲液中与一抗孵育过夜。其中CLSTN3抗体（Proteinch公司，货号13302-1-AP）的工作浓度为1∶500。免疫组化染色强度按文献^[7]计算H评分：H评分=1×%弱染色+2×%中度染色+3×%强染色，以H评分中位值98.63界定CLSTN3染色强度的高低表达。

1.3 细胞培养与质粒转染

正常人类结肠细胞NCM460和CRC细胞系（HCT8、LoVo、SW620、SW480和HCT116）购自中国科学院上海细胞所。细胞采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的1640培养基，置于37 ℃，5% CO₂的培养箱中进行培养。HCT8细胞转染分为两组：转染空载体的对照组（HCT8-CTRL组）和CLSTN3过表达载体组（HCT8-CLSTN3组）。HCT116细胞转染分为两组：转染空载体的对照组（HCT116-CTRL组）和CLSTN3小RNA干扰质粒组（HCT116-sh-CLSTN3组）。过表达质粒和小RNA干扰质粒由上海吉凯生物技术有限公司构建，转染效率通过荧光定量PCR和Western blot检测进行验证。

1.4 Western blot检测CLSTN3和APP蛋白表达

收集CRC组织和CRC细胞系，使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的总蛋白抽提试剂盒（中国杭州Beyotime公司）裂解。使用BCA试剂盒（中国杭州Beyotime公司）测定蛋白浓度。50 μg蛋白与上样缓冲液1∶1等体积比例混合后变性。10%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。蛋白质通过湿转法转移到PVDF膜上。用封闭缓冲液稀释的目标蛋白一抗孵育过夜。CLSTN3抗体（Proteinch公司，货号13302-1-AP）的工作浓度为1∶500。APP抗体（Proteinch公司，货号25524-1-AP）的工作浓度为1∶500。β-actin抗体（abcam公司，货号ab8227）的工作浓度为1∶500。

1.5 CCK-8法检测细胞生长

CCK-8试剂盒购自中国杭州Beyotime公司。对数生长期的HCT8和HCT116细胞经胰蛋白酶消化，计数后制成1~5×10⁴个细胞/mL的细胞悬液。分别取100 μL至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，分别在0、24、48、72 h后，按1∶10体积比混合CCK-8和无血清必需基本培养基，每孔100 μL加入待测孔中，在37 ℃，5% CO₂培养箱中孵育1 h；用酶标仪测定450 nm波长吸光度。记录每块板的数值。

1.6 BALB/c裸鼠皮下肿瘤形成实验

将4~6周龄的雄性BALB/c裸鼠分为：HCT8-CTRL组（n=5）、HCT8-CLSTN3组（n=5）、HCT116-CTRL组（n=5）和HCT116-sh-CLSTN3组（n=5）。将2×10⁶个细胞混合含20% Matrigel（美国BD公司），随后皮下注射至每只小鼠的右侧腹股沟。每周测量肿瘤生长情况，并按公式（长度×宽度²/2）计算肿瘤体积。4周后对所有小鼠进行安乐死，并使用电子天平测定肿瘤质量。

1.7 免疫共沉淀验证CLSTN3和APP相互作用

HCT8或HCT116细胞转染质粒48 h后，收集细胞并加入裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl pH值7.5，150 mmol/L NaCl，1% Nonidet P-40，1 mmol/L EDTA，8%甘油，1×蛋白酶抑制剂混合物（MCE）及1 mmol/L DTT（Amresco公司）]。将裂解液于4 ℃以12 000 r/min离心20 min。收集含蛋白质上清液，加入APP抗体（工作浓度为1∶500）或CLSTN3抗体（工作浓度为1∶500）孵育1 h，再与Protein G/Protein A Sepharose磁珠（Santa Cruz公司）在4 ℃下孵育18 h。将洗脱的蛋白置于1×SDS上样缓冲液中煮沸，经SDS-PAGE电泳分离，通过Western blot进行检测分析。实验重复进行3次。

1.8 生物信息学分析

利用GTEx（Genotype-Tissue Expression）数据库^[8]（www.gtexportal.org/home/index.html）分析CLSTN3 mRNA在正常结肠组织中表达水平。GEPIA数据库^[9]（http://gepia.cancer-pku.cn）分析CLSTN3 mRNA在CRC组织中表达水平。GeneMANIA数据库（http://genemania.org）^[10]预测CLSTN3相互作用分子网络。

1.9 统计学处理

定量资料采用均值±标准差（\overline{x}\pm s）表示，半定量计数资料组间比较采用Fisher精确概率法分析，Log-rank检验及Kaplan-Meier生存分析不同CLSTN3蛋白表达患者生存情况。单因素和多因素COX回归分析CRC患者预后影响因素，用GraphPad Prism Version 9.02软件分析制图。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 CLSTN3蛋白表达及其与CRC临床病理特征的关系

GTEx数据库分析发现，CLSTN3 mRNA在正常结肠组织中表达水平较低（图1A）；GEPIA数据库分析发现，CLSTN3 mRNA在结肠癌和直肠癌组织中表达水平高于正常结肠组织（图1B）。免疫组化方法检测313例石蜡组织样本CLSTN3的蛋白表达，在癌旁组织阳性表达率为27.2%（85/313），在癌组织阳性表达率为68.7%（215/313），CLSTN3染色主要定位细胞浆和细胞膜（图1C）。根据CLSTN3免疫组化评分中位值分为高表达组和低表达组，分析CLSTN3表达与临床病理特征的关系，结果显示，CLSTN3高表达与TNM分期、肿瘤坏死和神经脉管侵犯明显有关（P=0.001、P<0.001、P=0.028）（表1）。

2.2 CRC患者不良预后危险因素分析

Kaplan-Meier生存分析所示，CLSTN3高表达组整体生存（OS）率与无病生存（DFS）率均低于CLSTN3低表达组（均P<0.001）（图2）。OS相关单因素分析结果显示，T分期、N分期、TNM分期、病理类型、肿瘤坏死、神经脉管侵犯、血清CEA水平、CLSTN3表达与OS明显有关（均P<0.05）；将这些风险因子纳入多因素分析，结果显示，N分期、病理类型、CLSTN3表达是OS的独立影响因素（均P<0.05）（表2）。DFS相关单因素分析显示，手术方式、T分期、N分期、TNM分期、病理类型、肿瘤坏死、血清CEA水平、CLSTN3表达与DFS明显有关（均P<0.05）；将这些风险因子纳入多因素分析，结果显示，手术方式、T分期、N分期、血清CEA水平、CLSTN3表达是DFS的独立影响因素（均P<0.05）（表3）。

2.3 CLSTN3表达对CRC细胞体外生长的影响

相比正常结肠细胞NCM460，CLSTN3蛋白在CRC细胞系（HCT8、LoVo、SW620、SW480和HCT116）明显升高（图3）。Western blot检测了CLSTN3过表达HCT8细胞和CLSTN3敲减HCT116细胞（图4A-B）。CCK-8法检测体外细胞生长情况，发现CLSTN3过表达促进CRC细胞系HCT8生长，相反CLSTN3敲减抑制CRC细胞系HCT116生长（图4C-D）。

2.4 体内实验分析CLSTN3表达对CRC肿瘤生长的影响

体内实验使用裸鼠皮下移植瘤模型进行，每组5只。分别皮下注射稳定过表达CLSTN3的HCT8细胞及其转染空载体的对照HCT8细胞，结果显示，CLSTN3过表达组的移植瘤质量明显大于对照组[（0.388±0.031）g vs. （0.194±0.077）g，P=0.036]。而CLSTN3敲减HCT116组的移植瘤质量明显小于对照组[（0.158±0.024）g vs. （0.502±0.031）g，P=0.003]（图5）。

2.5 CLSTN3与APP相互作用关系在CRC细胞系中的验证

利用Genemania数据库预测了CLSTN3相互作用分子，包括共表达生理性相互作用、表达共定位、基因相互作用等（图6A）。表达共定位分子包括SCNN1D、APP、APOE、EPB41L1和CLSTN1（图6B）。基因相互调控作用分子包括CDIPT、APP、PHYHIP、EPB41L1和CLSTN2（图6C）。其中APP与CLSTN3之间的相互作用最为紧密，既有两者表达共定位的关系，也有基因相互调控作用的关系。通过免疫共沉淀分析发现，CRC细胞中存在CLSTN3与APP之间的直接相互结合（图7）。

2.6 CLSTN3与APP相互作用关系在CRC组织中的验证

基于CLSTN3与APP在CRC细胞中的表达特征，接下来用CRC组织标本验证了CLSTN3与APP之间的直接相互作用关系，通过Western blot分析了癌与癌旁配对CRC新鲜组织样本中CLSTN3与APP蛋白表达水平，结果显示，CLSTN3与APP蛋白在癌组织高于癌旁组织（图8A）。相关性分析结果显示，CLSTN3与APP之间的表达呈正相关（r=0.604，P=0.012）（图8B）。将17例癌与癌旁配对CRC新鲜组织样本分为有肿瘤坏死（n=12）和无肿瘤坏死（n=5）两组，CLSTN3与APP在有肿瘤坏死组中表达均高于无肿瘤坏死组（P<0.05）（图8C）。

3 讨　论

尽管肿瘤血清蛋白组学研究发现CLSTN3蛋白是CRC新的候选标志物和治疗靶点，目前为止，CLSTN3在CRC组织中的表达及临床意义尚不清楚，CLSTN3在CRC细胞中的作用机制也未有研究。本研究构建了一个“临床标本验证→体内外功能实验→分子网络预测→细胞和临床标本验证”的研究思路，聚焦于CLSTN3表达促进CRC肿瘤生长的功能。获得以下新的发现：⑴ 明确CLSTN3蛋白表达上调参与CRC发生发展。⑵ CLSTN3与TNM分期、肿瘤坏死和神经脉管侵犯等重要临床病理特征相关。CLSTN3表达上调直接影响CRC临床不良预后。⑶ CLSTN3促进CRC细胞生长的功能。⑷ CLSTN3与APP在CRC中存在相互作用关系。总体而言，CLSTN3在CRC中扮演着促进肿瘤生长的角色。

肿瘤快速生长通常发生肿瘤坏死病理表型。本研究发现，CLSTN3与APP在CRC组织样本中表达呈正相关，而且CLSTN3与APP在有肿瘤坏死组中表达均高于无肿瘤坏死组。近年来，肿瘤坏死在CRC中的预后价值逐渐受到关注。目前的研究证实了肿瘤坏死是CRC的独立预后因素^[11]。肿瘤坏死对早期CRC患者的独立预后作用。肿瘤坏死病理学有望帮助从早期CRC患者中识别高风险亚组，这些患者可能会从严格的随访和辅助治疗中受益^[12]。研究者普遍认识到，肿瘤坏死的许多过程涉及严重缺氧、炎症反应、免疫细胞浸润和血管生成^[13-15]。CLSTN3与寡糖转移酶（OST）亚基DDOST结合，抑制其与催化亚基STT3A的相互作用并破坏OST复合物的组装，从而减少TLR4的N-糖基化和膜转运。此外，CLSTN3还抑制其他TLR的膜转运和激活，包括TLR3、TLR7和TLR9^[16]。CLSTN3介导不可控炎症可能参与CRC发生发展。CLSTN3是一种跨膜蛋白，最近被发现参与脂质能量代谢。CLSTN3表达促进脂肪细胞脂解，并促进脂肪酸的氧化^[17]。CLSTN3还可以与白色脂肪组织中的APP相互作用，并增加APP在线粒体中的积累，从而损害脂肪组织的线粒体功能并促进肥胖^[18]。CLSTN3是否通过脂质代谢参与CRC肿瘤生长是本研究未探讨的问题，也是本研究存在的局限性之一。

CLSTN3在CRC中异常高表达，可能通过多重机制驱动肿瘤恶性进展。在结构上，CLSTN3与APP相似，共享胞外钙黏蛋白样结构域及胞内保守的磷酸化结合基序^[19]，并可经γ-分泌酶剪切产生胞内结构域（CLSTN3-ICD），后者可能作为转录共调节因子参与促癌信号转导^[20-21]。在功能上，CLSTN3可能通过激活PI3K/Akt及MAPK/ERK通路促进细胞增殖与克隆形成；同时，通过上调N-cadherin、Vimentin等间质标志物并下调E-cadherin，诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从而增强肿瘤细胞的侵袭与转移能力^[22]。此外，CLSTN3与APP可能在胞膜发生共定位，从而整合促存活、EMT及转移相关信号网络。综上，上述多重机制部分解释了本研究的发现，CLSTN3高表达与CRC晚期TNM分期显著相关，且是其独立的不良预后因素。

膜蛋白APP是调控阿尔茨海默病的关键分泌蛋白。近年来，APP在肿瘤细胞生长中的关键作用逐渐受到关注^[23]。研究^[24]表明，APP参与人结肠癌细胞在体内外的生长。在CRC发生肝转移的早期复发患者中APP表达水平通常上调了2倍以上^[25]。和阿尔茨海默病相比较，APP在CRC中的作用机制可能有所不同。主要通过以下几种方式驱动肿瘤进展：⑴ 释放胞内域：激活致癌通路，是最核心的机制^[26]。APP可以被肿瘤细胞中高表达的酶（如γ-分泌酶）切割，释放APP-ICD的片段。这个片段会进入细胞核，作为转录共激活因子，直接启动MYB、MYC等强效促癌基因的转录，从而驱动细胞无限增殖^[27]。⑵ 促进细胞干性与化疗耐药：通过激活Wnt/β-catenin等干性维持通路，让肿瘤细胞“干性”更强，这不仅是肿瘤复发和转移的根源，也是导致对5-FU、奥沙利铂等一线化疗药物耐药的重要原因^[28]。⑶ 重塑免疫微环境：肿瘤细胞分泌的APP可裂解为sAPPα和sAPPβ等片段，这些片段在肿瘤微环境中充当信号分子，会抑制CD8⁺ T细胞的浸润与杀伤功能，帮助肿瘤实现免疫逃逸^[29]。⑷ 代谢重编程：APP还能通过与线粒体蛋白相互作用，增强肿瘤细胞的有氧糖酵解，为快速增殖提供充足的能量和生物合成原料^[30]。CLSTN3与APP在CRC细胞系和肿瘤组织的共表达，但是CLSTN3是否作为APP下游的信号传导分子参与促进CRC肿瘤生长尚不清楚。也是本研究局限性之二。

综上所述，本研究首次分析了CLSTN3在CRC中的临床意义、促增殖作用及其与APP的相互作用关系，提示CLSTN3在CRC进展中可能发挥关键驱动作用。然而，本研究仅证实CLSTN3与APP存在相互作用关系，但尚未进一步阐明其下游信号通路及功能依赖性机制，后续仍需通过回复实验及通路阻断实验进一步验证。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(81372630)

湖南省自然科学基金资助项目(2023JJ40977)

湖南省自然科学基金资助项目(2022JJ30776)