GABRD促进肝细胞癌恶性进展及美金刚靶向干预作用研究

GABRD promotes malignant progression of hepatocellular carcinoma and is a therapeutic target of memantine

摘要

背景与目的 γ-氨基丁酸A型受体δ亚基（GABRD）在多种恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤进展，但其在肝细胞癌（HCC）中的生物学作用及药物干预价值尚不明确。本研究旨在探讨GABRD在HCC中的表达特征、促癌作用及其潜在分子机制，并筛选针对GABRD的候选药物。 方法 基于HCCDB和TCGA数据库分析GABRD表达及预后价值，并结合临床组织样本进行验证。采用CRISPR/Cas9敲除和慢病毒过表达技术构建GABRD功能获得与缺失模型，通过CCK-8、EdU、克隆形成、划痕愈合及Transwell实验评价其对HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响；利用皮下移植瘤、自发性肝癌及肺转移模型验证其体内作用。通过RNA测序结合GO、KEGG及GSEA分析探索其潜在机制。进一步采用结构基础虚拟筛选、分子对接及分子动力学模拟筛选靶向GABRD的小分子药物，并通过体内外实验验证其抗肿瘤作用。 结果 GABRD在HCC组织及细胞中显著高表达，其高表达与患者总体生存期、疾病特异性生存期及无进展生存期缩短密切相关。敲除GABRD显著抑制HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力，而过表达GABRD则产生相反效应。动物实验显示，GABRD缺失可明显抑制肿瘤生长和肺转移。转录组分析提示，GABRD可能通过调控细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT及上皮-间充质转化相关通路促进HCC进展。基于结构的虚拟筛选发现，美金刚与GABRD具有较高结合亲和力，并可下调GABRD表达水平。体内外实验进一步证实，美金刚能够显著逆转GABRD介导的促增殖、促侵袭及促转移作用。 结论 GABRD在HCC中高表达并促进肿瘤恶性进展，是潜在的不良预后标志物和治疗靶点。美金刚可通过靶向GABRD抑制HCC生长与转移，为HCC的靶向治疗及老药新用提供新的实验依据。

Abstract

Background and Aims Gamma-aminobutyric acid type A receptor delta subunit (GABRD) has been implicated in the progression of several malignancies, whereas its biological role and therapeutic relevance in hepatocellular carcinoma (HCC) remain largely unknown. This study aimed to investigate the expression pattern, oncogenic function, and potential molecular mechanisms of GABRD in HCC and to identify candidate small-molecule inhibitors targeting GABRD. Methods Public datasets from HCCDB and TCGA, together with clinical specimens, were used to evaluate GABRD expression and prognostic significance. Gain- and loss-of-function models were established using lentiviral overexpression and CRISPR/Cas9-mediated knockout approaches. Cell proliferation, migration, and invasion were assessed by CCK-8, EdU incorporation, colony formation, wound-healing, and Transwell assays. The in vivo effects were evaluated using subcutaneous xenograft, spontaneous HCC, and pulmonary metastasis models. RNA sequencing combined with GO, KEGG, and GSEA analyses was performed to explore downstream mechanisms. Structure-based virtual screening, molecular docking, and molecular dynamics simulations were applied to identify potential GABRD-targeting compounds, followed by in vitro and in vivo validation. Results GABRD was significantly upregulated in HCC tissues and cell lines, and its elevated expression was associated with unfavorable overall survival, disease-specific survival, and progression-free survival. GABRD knockout markedly inhibited HCC cell proliferation, migration, and invasion, whereas GABRD overexpression exerted opposite effects. In vivo studies further demonstrated that GABRD deficiency suppressed tumor growth and pulmonary metastasis. Transcriptomic analyses suggested that GABRD might promote HCC progression through cytokine-cytokine receptor interaction, JAK-STAT signaling, and epithelial-mesenchymal transition-related pathways. Structure-based virtual screening identified memantine as a potential GABRD-binding compound with high binding affinity. Memantine reduced GABRD expression and significantly reversed the pro-tumorigenic effects mediated by GABRD both in vitro and in vivo. Conclusion GABRD acts as an oncogenic regulator in HCC and may serve as a prognostic biomarker and therapeutic target. Memantine suppresses HCC growth and metastasis by targeting GABRD, providing experimental evidence for drug repurposing and novel targeted therapeutic strategies in HCC.

Graphical abstract

关键词

癌，肝细胞 / 受体，GABA-A / 美金刚

Key words

Carcinoma, Hepatocellular / Receptors, GABA-A / Memantine

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、进展迅速、易侵袭转移、预后差等特点，临床亟须寻找更为精准的预后标志物与安全有效的治疗靶点^[1-2]。

神经递质受体传统上主要在神经信号传导领域开展研究，如今已被越来越多地证实是肿瘤进展的关键调控因子。谷氨酸受体可通过激活MAPK通路及钙依赖通路，诱导代谢重编程促进肿瘤生长^[3-4]。烟碱型与毒蕈碱型乙酰胆碱受体介导的胆碱能信号，能够增强多种实体瘤的生长，其中尼古丁介导的受体激活对吸烟相关肿瘤进展尤为重要^[5-6]。在这些受体中，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）受体因其在癌症生物学中的双重作用而受到广泛研究。GABA主要通过离子型GABA_A受体和代谢型GABA_B受体信号通路调控肿瘤微环境的稳态^[7-8]。而GABA_A型受体δ亚基（GABA A receptor subunit δ，GABRD）作为A型受体的关键功能亚基，既往研究多聚焦于癫痫、抑郁等神经精神疾病^[9-11]。近年来，随着肿瘤神经生物学的快速发展，有研究^[12-13]发现GABRD可促进胃癌与结肠腺癌的恶性进展，揭示了一种依赖神经递质调控的肿瘤发生发展机制。此外，GABA合成关键酶—丙氨酸氨基转移酶2（glutamic pyruvate transaminase，GPT2）通过自分泌GABA，并作用于细胞膜上的GABRD，从而驱动乳腺癌转移^[14]。然而，GABRD在HCC中的表达特征、生物学功能及分子机制尚不清楚。

美金刚（memantine）是临床广泛应用的低亲和性非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体拮抗剂，主要用于阿尔茨海默病、帕金森病与脑卒中等神经系统疾病的保护治疗^[15-17]。近年来研究发现，美金刚在胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌等疾病中展现出显著的抗肿瘤活性，可通过抑制细胞增殖、侵袭及诱导细胞氧化应激损伤等途径延缓肿瘤恶性进展，具备良好的“老药新用”潜力^[18-21]。但其在HCC中的作用靶点与具体作用机制尚不明确。

本研究围绕GABRD在HCC中的功能及靶向干预展开系统探索。笔者发现美金刚可直接靶向结合GABRD并下调其表达，显著阻断GABRD介导的促癌效应，在体内外均能有效抑制HCC的恶性进展。本研究明确了GABRD在HCC中的促癌作用及其作为治疗靶点的价值，同时证实美金刚可通过靶向GABRD发挥抗HCC效应，为HCC提供了新的预后标志物与潜在干预策略，也为美金刚的临床新应用提供了实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

GABRD抗体购自Santa Cruz公司。E-cadherin、vimentin与Ki-67抗体购自Abcam公司。美金刚购自MCE公司。RNA提取试剂盒购自Axygen生物科技有限公司。逆转录试剂盒购自TOYOBO生物公司。qRT-PCR试剂盒购自赛维尔科技有限公司。

1.2 动物与细胞

BALB/c裸鼠：SPF级，雄性，4~6周龄，体质量18~22 g；C57BL/6小鼠：SPF级，雄性，5周龄，体质量16~18 g。小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，所有小鼠均饲养于中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院实验动物中心SPF级动物房，恒温22~24 ℃，12 h光暗循环，自由摄食饮水。本研究所有动物实验均经中国人民解放军陆军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准（伦理批号：AMUWEC20255434），严格遵循实验动物伦理规范。HCC细胞株MHCC97H、HCCLM3、HuH7、SNU-449，正常肝细胞株WRL68，以及小鼠肝癌细胞Hepa1-6均购自中国科学院上海细胞库。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

将处于对数生长期的HCC细胞接种于100 mm培养皿，用完全培养液（按照DMEM：胎牛血清：青霉素/链霉素=89∶10∶1的比例配制）孵育，在37 ℃、5% CO₂培养箱进行培养。

1.3.2 过表达/敲除细胞系构建

取对数生长期的HCC细胞，高表达GABRD的HCCLM3用于敲除，低表达的SNU-449用于过表达。使用靶向人源GABRD基因的特异性sgRNA，构建至CRISPR/Cas9慢病毒载体，包装病毒后感染HCCLM3细胞，敲除（knockout，KO）细胞内GABRD表达（HCCLM3-GABRD-KO）；使用含有非靶向sgRNA（non-targeting control sgRNA，NTC）的CRISPR/Cas9慢病毒感染HCCLM3细胞，作为KO组的阴性对照（HCCLM3-NTC）。将GABRD基因全长CDS序列构建至过表达（overexpression，OE）慢病毒载体，包装病毒后感染SNU-449细胞（SNU-449-GABRD-OE）；使用携带空载体的慢病毒感染SNU-449细胞，作为OE组的对照（SNU-449-control）。感染24 h后换液，48 h后加2 μg/mL嘌呤霉素筛选7~14 d，获得稳定细胞池，经qRT-PCR和Western blot验证敲除或过表达效率。

1.3.3 皮下瘤模型构建

将12只BALB/c裸鼠随机分成HCCLM3-NTC组和HCCLM3-GABRD-KO组，每组6只。每只裸鼠于右侧背部皮下注射150 μL细胞悬液。接种操作在生物安全柜内完成，确保无菌操作。

1.3.4 自发性肝癌模型构建

将20只5周龄C57BL/6小鼠随机平均分入对照组、GABRD敲低组（GABRD-KO组）、GABRD过表达组（GABRD-OE组）及阴性对照组。各组均通过水动力尾静脉注射基础质粒（pT3-AKT 10 μg、pT3-Myc 10 μg、pCAG-SB100 1.25 μg），并分别添加：对照组（pT3-EF1a-NC 10 μg）、GABRD-OE组（pT3-EF1a-GABRD 10 μg）、阴性对照组（pT3-U6-sgNC-EF1a-Cas9 10 μg）、GABRD-KO组（pT3-U6-sgGabrd-EF1a-Cas9 10 μg）。Sleeping Beauty转座酶介导质粒整合至肝细胞基因组，实现稳定表达或敲除。

1.3.5 肝癌肺转移模型构建

将稳定表达荧光素酶的小鼠Hepa1-6细胞（Hepa1-6-control/OE/NTC/KO）调整至1×10⁷个/mL。取6~8周龄C57BL/6小鼠20只，随机平均分为对照组、GABRD-OE组、NTC组、GABRD-KO组。每只经尾静脉缓慢注射100 μL细胞悬液（含1×10⁶个细胞）。注射后第6周，腹腔注射D-荧光素钠（150 mg/kg），异氟烷麻醉后于活体成像系统（IVIS），以Living Image软件定量肺部肿瘤负荷。

1.3.6 美金刚体内动物实验

自发性肝癌模型小鼠于流体动力学尾静脉注射后第7天开始给药。以10 mg/kg的安全剂量进行腹腔注射^[22]，每2 d给药1次，连续给药4周。第4周结束后处死小鼠，分离肝脏并统计肿瘤数量、测量肿瘤体积。

1.3.7 qRT-PCR

提取细胞或组织总RNA，测定纯度与浓度后，反转录合成cDNA。以GAPDH为内参，采用SYBR Green法进行qPCR扩增：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。通过2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.3.8 Western blot

提取细胞或组织总蛋白，BCA法定量。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳分离，湿转法转至PVDF膜（300 mA，90 min）。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（如抗GABRD，1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加HRP标记二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL化学发光显影，以GAPDH为内参。

1.3.9 CCK-8实验

将细胞接种于96孔板（每孔约2×10³个细胞），培养不同时间点（0、24、48、72 h）后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1~4 h，用酶标仪测定450 nm处吸光度，以反映活细胞数量。

1.3.10 EdU检测

将细胞接种于培养板或爬片，培养至合适密度后加入EdU工作液（终浓度10 μM），37 ℃孵育2 h。弃培养基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100通透20 min。加入Click反应液（含荧光染料、CuSO₄、抗坏血酸等），避光孵育30 min，Hoechst染核后于荧光显微镜下观察，计算EdU阳性细胞比例。

1.3.11 克隆形成实验

将各组肝癌细胞经胰酶消化并制备单细胞悬液，按合适密度接种于培养皿中，常规恒温培养箱持续培养10~14 d。待肉眼可见清晰细胞克隆后，弃培养液，PBS清洗细胞，多聚甲醛固定、结晶紫染色，清水漂洗并干燥，显微镜下计数≥50个细胞的克隆数目，统计分析组间克隆形成能力差异。

1.3.12 划痕实验

待各组HCC细胞在培养板内铺满至单层融合状态，使用无菌枪头垂直于板底均匀划直线划痕。PBS轻柔洗涤去除脱落细胞，更换无血清培养基培养。于划痕后0、24、48 h后显微镜拍照，测量划痕愈合宽度，计算细胞迁移率，评估细胞水平迁移能力。

1.3.13 Transwell实验

采用孔径为8 µm的Transwell小室先涂覆稀释的Matrigel基质。将5×10⁴个细胞接种于200 µL无血清培养基中，置于上室；下室则填充600 µL含10%胎牛血清的完全培养基作为趋化剂。孵育48 h后，用棉签轻柔去除膜上表面的未侵袭细胞；下表面的侵袭细胞经甲醇固定、结晶紫染色后，在显微镜下随机选取5个视野进行计数。

1.3.14 免疫荧光

细胞爬片免疫荧光简要步骤：将细胞接种于爬片，培养至合适密度后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100通透15 min，5% BSA室温封闭30 min。加入一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后加荧光标记二抗室温避光孵育1 h，DAPI染核，封片后于荧光显微镜下观察。

1.3.15 免疫组化

切片脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，3% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，5% BSA封闭30 min，滴加一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染，封片后观察棕黄色阳性信号。

1.3.16 HE染色

组织经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后切片（4 μm），脱蜡至水，苏木精染色5~10 min，盐酸乙醇分化，伊红染色2~3 min，脱水透明后封片，光镜下观察细胞核（蓝紫色）及胞质/间质（粉红色）。

1.3.17 转录组测序与生物信息学分析

转录组测序（RNA-seq）先通过文库构建与高通量测序获得基因表达定量数据。在此基础上，基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析利用超几何检验将差异表达基因按生物学过程、细胞组分和分子功能三类进行功能注释；KEGG通路分析则同样基于差异基因，识别显著富集的代谢或信号通路；GSEA将所有基因按与表型的关联度排序，评估预设基因集在排序列表中的整体富集趋势。

1.3.18 小分子药物筛选

以GABRD的AlphaFold预测结构为靶点，经Schrödinger软件预处理、SiteMap模块定义活性位点后，对FDA批准的小分子化合物库进行类药性筛选及Glide高通量分子对接，依据对接评分及相互作用特征筛选候选分子；选取对接最优分子与GABRD构建复合物，采用GROMACS软件、CHARMM36力场进行100 ns分子动力学模拟，经能量最小化、NVT及NPT平衡后，分析复合物回转半径、同时根均方偏差、氢键及吉布斯自由能景观以验证构象稳定性。

1.4 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.0及SPSS 25.0分析数据。计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，两组比较用t检验（独立或配对），多组比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 GABRD在HCC组织中高表达，并与HCC患者不良预后相关

首先利用HCCDB数据库在单细胞水平分析GABRD在细胞中的表达情况。分析显示，恶性HCC细胞中GABRD表达水平显著高于邻近的非癌细胞及正常肝细胞（图1A-B）。基于TCGA-LIHC数据库分析也证实了这种上调现象，与正常肝组织相比，GABRD mRNA在HCC组织中显著上调（P<0.05）（图1C）；在配对癌与癌旁组织比较中，GABRD在癌组织中同样呈明显高表达（P<0.05）（图1D）。进一步按肿瘤分期分析发现，T1~T4各期HCC组织中GABRD表达均显著高于正常组织（P<0.05）（图1E）。依据表达均值将患者分为高低表达组，Kaplan-Meier生存分析显示，高表达组总生存期（图1F）、疾病特异性生存期（图1G）及无进展生存期（图1H）均显著缩短。综上，GABRD在HCC中高表达，可作为预测患者不良预后的潜在分子标志物。HCC组织芯片免疫组织化学染色结果显示，在正常肝组织和癌旁组织中，GABRD呈现低表达或不表达，而在HCC组织中可见明显的阳性染色（P<0.05）（图1I）。后续Western blot结果显示，癌组织中GABRD蛋白水平显著高于其配对的癌旁组织（P<0.05）（图1J）。同时HCC细胞系中GABRD的蛋白与mRNA表达水平均高于正常肝永生细胞WRL68（均P<0.05）（图1K-L）。值得注意的是，具有高转移潜能的HCCLM3和MHCC97H细胞中GABRD的表达水平最高，而相对低转移潜能的HuH7和SNU-449细胞中GABRD的表达水平相对较低。

2.2 敲除GABRD抑制HCC细胞增殖、侵袭与迁移

选择内源性GABRD相对高表达的HCCLM3细胞进行CRISPR/Cas9介导的GABRD敲除实验（P<0.05）（图2A-B）。CCK-8检测显示，GABRD-KO组的HCCLM3细胞增殖速率相较于对照组显著降低（P<0.05）（图2C）。EdU染色同样提示，GABRD-KO明显抑制HCC细胞增殖速度（P<0.05）（图2D）。而平板克隆形成实验发现敲除HCC细胞中GABRD后形成的细胞克隆数量显著少于NTC组（P<0.05）（图2E）。HCC细胞的迁移和侵袭能力是肿瘤发生远处转移的关键步骤。后续划痕实验提示，GABRD-KO组细胞的划痕愈合率低于NTC组（P<0.05）（图2F），提示敲除GABRD抑制了细胞的迁移运动。Transwell实验结果显示，敲除GABRD后明显抑制了HCC细胞的侵袭潜能（P<0.05）（图2G）。

2.3 过表达GABRD促进HCC细胞增殖、侵袭与迁移

随后笔者在GABRD相对低表达的SNU-449细胞中过表达GABRD（P<0.05）（图3A-B）。CCK-8检测结果显示，与空载体对照组相比，GABRD过表达组（GABRD-OE组）的SNU-449细胞增殖能力显著高于对照组（P<0.05）（图3C）。EdU实验结果进一步支持了这一结论：GABRD-OE组中EdU阳性细胞比例显著高于对照组（P<0.05，图3D）。平板克隆形成实验展示了同样的结果（P<0.05）（图3E）。划痕与Transwell实验则显示过表达GABRD后对HCC细胞迁移与侵袭能力的促进作用（P<0.05）（图3F-G）。以上结果证实：GABRD在体外显著促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

2.4 沉默GABRD抑制小鼠体内HCC肿瘤的生长与远处转移

为从体内层面探究GABRD对HCC进展的调控效用。笔者利用GABRD-KO与相应对照细胞构建裸鼠皮下瘤模型。与阴性对照组相比，GABRD敲除组的肿瘤生长速度明显延缓，平均肿瘤体积也显著小于阴性对照组（P<0.05）（图4A-C）。肿瘤组织Ki-67免疫组化染色结果显示，GABRD-KO组肿瘤组织中Ki-67阳性区域的平均光密度值低于阴性对照组（P<0.05）（图4D），表明GABRD敲除抑制了肿瘤细胞在体内的增殖活性。同时利用Myc和Akt质粒构建了小鼠自发性肝癌模型。质粒注射后4周，所有小鼠肝脏均成功形成肿瘤。与阴性对照组相比，注射GABRD敲除质粒的小鼠肝脏的肿瘤结节数量显著减少，同时最大肿瘤结节直径也较小（P<0.05）（图4E-F）。鉴于体外实验证实了GABRD能够增强HCC细胞的迁移与侵袭能力，笔者推测其可能促进小鼠体内HCC远处转移的能力。小鼠肺转移模型结果提示敲除GABRD后能够明显抑制HCC细胞肺转移能力（P<0.05）（图4G）。小鼠肺脏HE染色结果显示，GABRD敲除组的肺转移结节数量显著少于阴性对照组（P<0.05）（图4H）。上述结果表明，沉默小鼠体内GABRD能够抑制HCC远处转移。

2.5 细胞因子及受体相互作用可能参与GABRD诱导的HCC进展

为进一步明确GABRD诱导HCC进展的潜在机制，笔者对两组小鼠HCC自发瘤组织进行了转录组测序。与对照小鼠相比，GABRD敲除组有205个基因表达显著上调，232个基因表达下调（图5A）。GO分析结果提示，GABRD可能通过调节细胞迁移、运动过程参与HCC进展（生物过程）（图5B）；细胞组分分类显示细胞表面受体复合物及细胞膜成分具有重要生物学活性（图5C）；分子功能分类揭示细胞因子及受体轴、蛋白结合等功能参与GABRD发挥的促肿瘤效应（图5D）。KEGG通路分析同样提示，GABRD与细胞因子-受体以及促细胞生长相关信号通路存在显著相关性（图5E）。而GSEA结果显示，GABRD与上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）存在正向调控关系（P<0.05）（图5F）。免疫荧光实验通过对EMT通路相关指标进行检测，证实敲除GABRD后能够明显抑制EMT通路的激活（P<0.05）（图5G）。上述高通量测序结果提示GABRD可能通过调控细胞因子-受体信号轴参与HCC的增殖与转移过程。

2.6 美金刚通过下调GABRD表达发挥抑制HCC进展作用

为探究GABRD的药理抑制特性，可视化GABRD的蛋白质结构，并基于GABRD的跨膜结构域（图6A），对FDA批准的小分子化合物文库进行了虚拟筛选。其中NMDA受体拮抗剂—美金刚与GABRD对接评分最高（图6B）。后续对美金刚-GABRD复合物进行分子动力学模拟，结果显示，GABRD回转半径、复合物间存在持续氢键相互作用，同时根均方偏差（root mean square deviation，RMSD）与根均方波动（root mean square fluctuation，RMSF）曲线稳定，存在持续氢键相互作用，并在自由能形貌图中呈现紧凑的低能阱区，提示二者可形成构象稳定的结合状态（图6C-I）。上述结果一致表明美金刚可以与GABRD稳定结合，并对GABRD发挥调节作用。进一步体外功能实验发现，美金刚通过浓度依赖性方式下调GABRD蛋白表达（P<0.05）（图7A），同时显著逆转GABRD发挥的促HCC细胞增殖、侵袭与迁移作用（10 μm）（P<0.05）（图7B-F）。体内实验显示，小鼠经腹腔注射美金刚（10 mg/kg）后，GABRD过表达组肝脏自发肿瘤的生长受到明显抑制（P<0.05）（图7G）。同时，美金刚还可抑制GABRD过表达诱发的HCC肺转移效应（P<0.05）（图7H-I）。

3 讨　论

本研究证实GABRD在HCC中显著高表达并与患者不良预后密切相关。并通过体内体外实验证实了GABRD对HCC增殖与侵袭转移的促进作用。同时，基于结构的虚拟筛选技术发掘出靶向抑制GABRD的小分子药物—美金刚。本研究揭示了美金刚/GABRD轴作为干预HCC进展的新发现，为肝癌靶向治疗提供了新的实验依据与理论基础。

传统研究中神经递质受体主要聚焦于神经信号调控，而近年研究证实谷氨酸受体、胆碱能受体、多巴胺及5-羟色胺受体等均可通过调控肿瘤细胞增殖、血管生成、免疫微环境等参与肿瘤进展^[3,6,23-24]。前期研究发现GABRD作为GABA_A受体在胶质瘤、食管癌及乳腺癌进展过程中发挥关键调节作用。在胶质瘤进展过程中，GABRD与肿瘤浸润巨噬细胞及集落刺激因子1（colony stimulating factor 1，CSF1）呈负相关，高表达GABRD可抑制巨噬细胞浸润，进而诱导抗肿瘤免疫微环境^[25]；Yuan等^[26]证实，GABRD与DEP结构域蛋白质1B（DEP domain containing protein 1B，DEPDC1B）的蛋白复合物，通过PI3K/Akt/mTOR信号通路来调控食管鳞状细胞癌的发展进程；此外，谷氨酰胺代谢和GABA信号通路在肿瘤的迁移和侵袭过程中也发挥着关键作用。GPT2水平的升高会促进谷氨酰胺的代谢，从而增加GABA的生成。GABA通过激活GABRD，提高细胞内钙离子浓度，进而激活PKC-CREB信号通路，促进乳腺癌转移^[14]。本研究初步发现，GABRD通过调控细胞膜细胞因子-细胞因子受体通路与JAK-STAT信号轴促进HCC进展的潜在可能性，拓展了神经递质受体介导HCC发生发展的理论体系，提示GABA能信号异常是HCC进展的重要特征之一。笔者也将在未来的研究中进一步明确上述猜想。

GABRD在多种肿瘤中发挥促癌作用，但其在HCC中可被小分子药物靶向调控的效应尚未报道^[27]。既往研究证实，美金刚通过抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡发挥抗肿瘤活性。Albayrak等^[28]发现美金刚通过诱导癌细胞凋亡缓解前列腺癌进展；同时，美金刚还能够抑制细胞周期相关蛋白的表达，从而作为治疗卵巢癌的辅助用药^[29]。目前美金刚对HCC辅助治疗作用尚不清楚。本研究基于GABRD蛋白结构进行虚拟筛选，发现美金刚可与GABRD直接稳定地结合，且美金刚可显著下调GABRD的蛋白表达水平。研究报道，小分子药物可通过分子胶方式，诱导靶蛋白的泛素化降解发挥作用；还可人工通过蛋白降解靶向嵌合体技术，诱导靶蛋白多聚泛素化，随后被蛋白酶体识别并降解^[30]；同时，小分子药物结合靶蛋白的变构位点可诱导其构象变化，降低靶蛋白稳定性^[31]。因此，笔者推测，美金刚可能通过上述方式诱导GABRD蛋白的降解。

尽管本研究明确了GABRD对HCC恶性生物学行为的促进作用，但经高通量测序探索的GABRD调控HCC进展的具体分子机制仍待进一步验证。既往研究^[32-35]证实，细胞因子可通过结合其细胞膜上相应受体，激活下游JAK-STAT通路，进而维持细胞活力促进肿瘤进展。本研究测序结果提示，GABRD过表达可显著富集细胞因子-细胞因子受体与JAK-STAT信号通路，并诱导HCC细胞生长与迁移。然而，当前仍缺乏直接证据以及相应实验对上述推测进行系统验证。GABRD作为膜受体，是否通过调控细胞因子受体的多聚化水平而影响相关信号通路的激活？同时，美金刚又是通过何种方式下调GABRD蛋白水平的？针对上述仍不明确的问题，后续研究中仍需深入探索与系统验证。本研究仍存在一定局限性：首先，临床样本量相对有限；其次，RNA测序提示的细胞因子-细胞因子受体及JAK-STAT信号通路尚缺乏进一步机制验证；此外，美金刚与GABRD的直接结合及其诱导GABRD下调的分子机制仍需通过生化实验进一步证实。未来将结合功能回复实验及蛋白互作研究进一步阐明其作用机制。

综上，本研究证实GABRD在HCC中显著高表达并促进肿瘤增殖与转移，与患者不良预后密切相关。基于结构的虚拟筛选发现美金刚可直接靶向GABRD，从而有效抑制HCC进展，为“老药新用”提供依据。机制上，生物信息学分析初步提示细胞因子-细胞因子受体及JAK-STAT通路参与GABRD介导的促肿瘤效应。GABRD有望作为判断HCC预后的标志物，为肝癌靶向治疗提供新策略。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82300727)

重庆市卫生健康委医学青年拔尖人才基金资助项目(YXQN2025008)

重庆市自然科学基金资助项目(CSTB2025NSCQ-GPX0061)

陆军军医大学科技创新能力提升专项基金资助项目(2022XQN30)