MicroRNA-155、microRNA-146a水平评估慢性阻塞性肺疾病急性加重期疾病严重程度的价值

Value of microRNA-155 and microRNA-146a levels in assessing disease severity in acute exacerbation of COPD

摘要

目的 探讨microRNA-155（miR-155）、microRNA-146a（miR-146a）水平与慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期疾病严重程度及频繁发作风险的关系。 方法 选取2021年5月—2023年5月在吕梁市第一人民医院接受治疗的152例COPD患者，稳定期COPD患者94例纳入稳定组，急性加重期COPD患者58例纳入加重组，另取同期该院46例健康体检者作为对照组。比较疾病不同严重程度下miR-155、miR-146a水平的变化，同时探讨急性加重患者发作频繁的影响因素，评估miR-155、miR-146a水平在COPD急性加重期的价值。 结果 加重组与稳定组患者miR-155水平均高于对照组（P <0.05），加重组患者miR-155水平高于稳定组（P <0.05）。加重组与稳定组患者miR-146a水平均低于对照组（P <0.05），加重组患者miR-146a水平低于稳定组（P <0.05）。Spearman相关性分析结果显示：miR-155水平与疾病严重程度呈正相关（r_s =0.602，P <0.05）；miR-146a水平与疾病严重程度呈负相关（r_s =-0.588，P <0.05）。加重组不同严重级别患者miR-155水平和miR-146a水平比较，差异均有统计学意义（P <0.05）。频繁组年龄≥60岁占比、吸烟史率、冠心病史率、糖尿病史率、病情评估C/D级占比、COPD评估测试（CAT）评分和miR-155水平均高于非频繁组，miR-146a水平低于非频繁组（P <0.05）。多因素一般Logistic回归分析结果显示：年龄≥60岁［O^R=6.713（95% CI：1.770，25.461）］、病情评估为C/D级［O^R=3.039（95% CI：1.237，7.464）］、高CAT评分［O^R=15.152（95% CI：2.865，80.137）］、高miR-155水平［O^R=8.975（95% CI：1.625，49.551）］、低miR-146a水平［O^R=0.212（95% CI：0.063，0.710）］均是COPD加重期患者频繁发作的危险因素（P <0.05）。miR-155与miR-146a联合预测的诊断效能最佳，曲线下面积为0.906（95% CI：0.829，0.982），敏感性为76.9%（95% CI：0.647，0.875），特异性为89.5%（95% CI：0.813，0.948）。 结论 miR-155、miR-146a水平可作为评估COPD急性加重期疾病严重程度的生物标志物，对于指导临床治疗决策具有重要意义。

Abstract

Objective To investigate the relationship between microRNA-155 (miR-155) and microRNA-146a (miR-146a) levels and disease severity and the risk of frequent exacerbations in patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Methods A total of 152 patients with COPD who received treatment at Lvliang First People's Hospital between May 2021 and May 2023 were enrolled. Among them, 94 patients with stable COPD were assigned to the stable group, and 58 patients with acute exacerbation of COPD were assigned to the exacerbation group. In addition, 46 healthy individuals who underwent health checkups during the same period were selected as the control group. Changes in miR-155 and miR-146a levels among patients with different disease severities were compared. Factors influencing frequent exacerbations in patients with acute exacerbation were analyzed, and the value of miR-155 and miR-146a levels during acute exacerbation of COPD was evaluated. Results The miR-155 levels in both the exacerbation group and the stable group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05), and the miR-155 level in the exacerbation group was significantly higher than that in the stable group (P < 0.05). The miR-146a levels in both the exacerbation group and the stable group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05), and the miR-146a level in the exacerbation group was significantly lower than that in the stable group (P < 0.05). Spearman correlation analysis showed that miR-155 levels were positively correlated with disease severity (r_s = 0.602, P = 0.000), whereas miR-146a levels were negatively correlated with disease severity (r_s = -0.588, P = 0.000). There were statistically significant differences in miR-155 and miR-146a levels among patients in Groups A, B, C, and D (P < 0.05). Compared with the non-frequent exacerbation group, the frequent exacerbation group had higher proportions of patients aged ≥60 years, with a smoking history, a history of coronary heart disease, a history of diabetes mellitus, and GOLD group C/D classification, as well as higher COPD Assessment Test (CAT) scores and miR-155 levels, while miR-146a levels were lower. Multivariable logistic regression analysis showed that age ≥60 years [O^R = 6.713 (95% CI: 1.770, 25.461) ], GOLD group C/D classification [O^R = 3.039 (95% CI: 1.237, 7.464) ], high CAT score [O^R = 15.152 (95% CI: 2.865, 80.137) ], high miR-155 level [O^R = 8.975 (95% CI: 1.625, 49.551) ], and low miR-146a level [O^R = 0.212 (95% CI: 0.063, 0.710) ] were risk factors for frequent exacerbations in patients with acute exacerbation of COPD (P < 0.05). The combination of miR-155 and miR-146a showed the best diagnostic performance, with an area under the curve (AUC) of 0.906 (95% CI: 0.829, 0.982), sensitivity of 76.9% (95% CI: 64.7%, 87.5%), and specificity of 89.5% (95% CI: 0.813, 0.948). Conclusion The levels of miR-155 and miR-146a can serve as valuable biomarkers for assessing the severity of disease in the acute exacerbation stage of COPD and are of great significance for guiding clinical treatment decisions.

Graphical abstract

关键词

慢性阻塞性肺疾病 / 急性加重期 / miR-155 / miR-146a / 疾病严重程度

Key words

chronic obstructive pulmonary disease / acute exacerbation / miR-155 / miR-146a / disease severity

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一种常见的慢性呼吸系统疾病，以气流受限为特征，严重影响患者的生活质量^[1]。COPD的急性加重期是指患者的症状突然恶化，此时患者需要紧急治疗，这对患者的健康和医疗系统都是一大负担。COPD急性加重期的诊断和治疗效果评估对于改善患者预后和减轻医疗负担具有重要意义^[2]。

近年来，microRNA（miRNA）作为调控基因表达的一种重要分子，在多种疾病的发病机制中发挥着关键作用^[3]。特别是在COPD的研究中，microRNA-155（miR-155）、microRNA-146a（miR-146a）被发现与疾病的发展和加重过程密切相关。具体来说，miR-155在促进炎症细胞活化和增殖方面发挥作用，miR-146a则通过负反馈机制调节炎症反应，对维持肺部组织的稳态和抑制过度的免疫反应具有重要意义^[4-5]。miR-155和miR-146a的表达水平变化与COPD患者的病情严重程度及急性加重风险密切相关。本研究主要探讨miR-155和miR-146a水平在评估COPD急性加重期疾病严重程度及频繁发作风险中的价值。

1 资料与方法

1.1　一般资料

选取2021年5月—2023年5月在吕梁市第一人民医院收治的152例COPD患者为研究对象，稳定期COPD患者94例纳入稳定组，急性加重期COPD患者58例纳入加重组，另取同期本院46例健康体检者作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会审批同意（lykyll2021-03）。

1.2　纳入与排除标准

1.2.1　纳入标准

①符合COPD的诊断标准^[6]；②加重组患者符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重（AECOPD）诊治中国专家共识（2017年更新版）》的诊断标准^[7]，特征为慢性咳嗽和咳痰的显著加剧，伴有气喘和痰量的增加；③稳定组患者在过去3个月内症状保持稳定，需支气管扩张剂及糖皮质激素治疗^[8]；④完整的临床资料和随访记录。

1.2.2　排除标准

①患有其他严重呼吸系统疾病或原发及继发性肺部疾病；②近1周内服用免疫抑制剂或影响炎症反应的药物；③患有重大心脏疾病、肝功能异常、脑血管疾病等；④合并有恶性肿瘤、严重免疫缺陷或传染病；⑤合并有精神障碍无法配合研究或依从性差。

1.3　方法

1.3.1　临床资料收集

收集患者年龄、性别、体质量指数（body mass index, BMI）、病程、吸烟史、冠心病史、糖尿病史、改良医学研究委员会呼吸困难分级（modified medical research council dyspnea scale, mMRC）分级、病情评估、COPD评估测试（COPD assessment test, CAT）。①mMRC分级^[9]：mMRC是专门用于评估COPD患者呼吸困难程度的量表，主要涉及日常活动中呼吸困难的程度，分为0～4级，级别越高表示患者呼吸困难程度越严重。②病情评估^[10]。A级：患者急性发作较少，年发作≤2次，症状轻微，mMRC呼吸困难问卷得分为0～1分，且肺功能检测提示轻至中度气流限制。B级：在急性发作风险同样低的情况下，表现出更多症状且mMRC评分>2分。C级：面临较高的急性发作风险，肺功能显示重至极重度气流受限，年急性发作次数>2次，但症状相对较轻。D级：在高急性发作风险的同时呈现较多症状。③CAT评分^[11]：CAT评分用于全面评估COPD影响，涉及咳嗽的频率、痰量、胸闷、活动受限、睡眠质量、呼吸困难、精力水平及对日常生活的影响等方面。根据患者的回答，总分0～40分，分数越高表示COPD的影响越严重，患者的生活质量受到的影响越大。

1.3.2　miR-155、miR-146a水平检测

本研究利用美国赛默飞公司ABI Q6 Flex实时荧光定量PCR设备对外周血中miR-155、miR-146a的表达水平进行定量分析。实验过程中，抽取研究对象3～5 mL空腹静脉血样本，3 000 r/min离心10 min，提取上层血清。后续采用日本TaKaRa公司的TRIzol试剂提取血清总RNA，进一步进行miR-155、miR-146a的反转录合成。PCR反应条件如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。扩增结束后，进行熔解曲线分析，验证扩增特异性。miR-155、miR-146a及内参U6的特定引物序列见表1。采用2^-ΔΔCt法对二者在血清中的相对表达水平进行计算与分析。所有样本均进行3次重复检测，取平均值用于统计分析；内参U6在各组间Ct值比较，差异无统计学意义（P >0.05），其表达稳定性良好，可作为可靠的内参基因。

1.3.3　分组及随访情况

随访记录患者1年内的急性就诊频率，归为两组：频繁组39例（年就诊次数≥2次）和非频繁组19例（年就诊次数<2次）。疾病进程以患者首次出现AECOPD并伴有运动耐力减退的日期为准。

1.4　统计学方法

数据分析采用SPSS 27.0和R3.4.3统计软件。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用独立样本t 检验，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ²检验；相关性分析用Spearman法；影响因素的分析采用多因素一般Logistic回归模型；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　不同严重程度患者的miR-155、miR-146a水平比较

加重组、稳定组和对照组miR-155水平和miR-146a水平比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）；加重组与稳定组患者miR-155水平均高于对照组（P <0.05）；加重组患者miR-155水平高于稳定组（P <0.05）。加重组与稳定组患者miR-146a水平均低于对照组（P <0.05），加重组患者的miR-146a水平低于稳定组（P <0.05）。见表2。

Spearman相关性分析结果显示，miR-155水平与疾病严重程度呈正相关（r_s =0.602, P =0.000）；miR-146a水平与疾病严重程度呈负相关（r_s =-0.588, P =0.000）。见图1。

2.2　加重组不同严重程度患者miR-155、miR-146a水平比较

加重期病情评估为A、B、C、D级患者分别有14、20、15、9例，并分别作为A、B、C、D组。A组、B组、C组及D组患者miR-155水平和miR-146a水平比较，经单因素方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较结果显示：B组、C组、D组患者miR-155水平均高于A组（P <0.05），C组、D组患者miR-155水平均高于B组（P <0.05），D组患者miR-155水平高于C组（P <0.05）。B组、C组、D组患者miR-146a水平均低于A组（P <0.05），C组、D组患者miR-146a水平均低于B组（P <0.05），D组患者miR-146a水平低于C组（P <0.05）。见表3。

2.3　两组患者临床资料比较

根据随访结果，频繁发作组有39例（67.24%），非频繁发作组有19例（32.76%）。频繁组与非频繁组性别构成、BMI、病程构成和mMRC分级构成比较，经t /χ²检验，差异均无统计学意义（P >0.05）；频繁组与非频繁组年龄构成、吸烟史率、冠心病史率、糖尿病史率、病情评估构成、CAT评分、miR-155水平和miR-146a水平比较，经t /χ²检验，差异均有统计学意义（P <0.05）。频繁组年龄≥60岁占比、吸烟史率、冠心病史率、糖尿病史率、病情评估C/D级占比、CAT评分和miR-155水平均高于非频繁组，miR-146a水平低于非频繁组。见表4。

2.4　COPD急性加重期患者频繁发作的多因素一般Logistic回归分析

以是否频繁发作COPD（否=0，是=1）为因变量，单因素分析中差异有统计学意义的年龄（<60岁=0，≥60岁=1）、吸烟史（否=0，是=1）、冠心病史（否=0，是=1）、糖尿病史（否=0，是=1）、病情评估（A/B级=0，C/D级=1）、CAT评分（实测值）、miR-155水平（实测值）、miR-146a水平（实测值）为自变量，进行多因素一般Logistic回归分析，结果显示：年龄≥60岁[O^R=6.713（95% CI：1.770，25.461）]、病情评估为C/D级[O^R=3.039（95% CI：1.237，7.464）]、高CAT评分[O^R=15.152（95% CI：2.865，80.137）]、高miR-155水平[O^R=8.975（95% CI：1.625，49.551)]、低miR-146a水平[O^R=0.212（95% CI：0.063，0.710）]是COPD加重期患者频繁发作的危险因素（P <0.05）。见表5。

2.5　miR-155、miR-146a水平对COPD急性加重期患者频繁发作的预测价值

ROC曲线分析结果显示，miR-155、miR-146a单独及联合对COPD急性加重期患者频繁发作均具有一定预测价值。进一步联合分析结果显示，miR-155与miR-146a联合预测的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.906（95% CI：0.829，0.982），敏感性为76.9%（95% CI：0.647，0.875），特异性为89.5%（95% CI：0.813，0.948）。见表6和图2。

3 讨论

COPD是一种复杂的临床状况，其发展涉及多种机制，包括气流受限、慢性炎症反应、氧化应激和免疫系统失调等^[12]。COPD急性加重期通常表现为呼吸困难、咳嗽和痰液增加，随着病情的发展，患者可能出现肺功能进一步下降，最终可能导致呼吸衰竭^[13-14]。Leong等^[15]研究显示，COPD急性加重期还增加心血管疾病的发生风险，约1/3患者存在严重的冠状动脉疾病，约10%的患者存在射血分数降低的心力衰竭。在COPD的诊断中，虽然肺功能测试和胸部X射线检查作为常规方法被广泛使用，但其在早期COPD的检测上存在局限性^[16-17]。因此，开发早期、非侵入性且敏感的生物标志物对于提高COPD诊断及急性加重期的早期检测和干预显得尤为关键。如席卓娜等^[18]对COPD急性加重期患者的血清miR-155和miR-146a表达进行研究，表明COPD患者的炎症表型与上述指标密切相关。

本研究显示miR-155水平在COPD的严重程度增加时显著上升，表明其可能在疾病进展中起促炎作用。相反，miR-146a的表达水平在COPD严重程度增加时下降，暗示其在炎症反应中起到负调节的作用。miR-155在COPD的病理生理中起着关键作用，特别是在调节免疫应答和气道炎症中。miR-155的表达上调可能是对气道中慢性炎症刺激的反应，这种上调与免疫细胞，尤其是巨噬细胞的活化密切相关^[19]。在COPD的背景下，de Smet等^[20]研究显示，miR-155的作用与香烟烟雾诱导的炎症有关，表明其参与该疾病的发病机制。因此，COPD患者中miR-155的上调，特别是急性加重期间，可能导致炎症水平增加。与miR-155不同，miR-146a在COPD中的降低涉及炎症反应的调控失衡。miR-146a通常功能限制炎症信号的过度活化，特别是在调节Toll样受体和核因子κB信号通路中^[21]。这一过程可能与慢性炎症反应的维持和气道重塑有关，进而影响COPD的病程及急性加重风险。miR-146a的降低在COPD急性加重期间的作用尤为显著，因为这一时期炎症反应通常更为剧烈和持续^[22]。多因素一般Logistic回归分析结果显示，年龄≥60岁、病情评估为C/D级、高CAT评分、高miR-155水平、低miR-146a水平均是COPD患者频繁发作的危险因素。目前已有多项研究表明，随着年龄的增长，COPD患者加重的风险增加，这可能与老年人的生理功能下降和对疾病适应能力减弱有关^[23-24]。CAT评分高表明患者的整体健康状况较差，与COPD病情加重和更多急性加重事件密切相关^[25]。本研究ROC曲线分析结果显示，miR-155、miR-146a单独及联合对COPD急性加重期患者频繁发作均具有一定预测价值。本研究仍存在一定的局限性：样本量相对较小，可能影响结果的普遍性和统计功效；研究仅限于单一中心且缺乏长期随访数据，无法评估miR-155和miR-146a水平变化对患者长期疾病进展及反复加重风险的影响。上述因素均可能对COPD急性加重期的病理生理和治疗反应产生影响。

综上所述，miR-155、miR-146a水平与COPD患者的疾病严重程度相关，年龄≥60岁、病情评估为C/D级、高CAT评分、高miR-155水平、低miR-146a水平是COPD患者频繁发作的危险因素。miR-155及miR-146a水平与COPD急性加重期患者频繁发作风险密切相关。

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基金资助

山西省自然科学基金(WR202310965)